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1、.聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白[实验目的](1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。[实验原理]带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N¢，N¢—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称
2、为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。[实验试剂]1、待测样品：新鲜血清2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：(1)凝胶缓冲液：称取1mol/LHCl48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED0.23mL,加重蒸馏水至80mL使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL，至棕色瓶，冰箱储藏。(2)分离胶贮液，一般有两种配法：ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.ⅱ30％Acr-0.
3、8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存
4、。(6)40％蔗糖溶液（W/V）范文.(7)核黄素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4℃贮存.以上(4)-(7)4种溶液用于配置浓缩胶.3.Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900mL,调pH之后定容至1000mL,4℃贮存,使用前稀释10倍.4.0.1％溴酚蓝指示剂.5.染色液染色液种类较多,染色方法也不完全相同,详细染色法如下:方法固定染液染色时间脱色氨基黑-10B甲醇7％乙酸0.1mol/LNaOH中1％氨基黑7％乙酸中0.5％-1％氨基黑5min(室温)2h(室温)/10mi
5、n(96℃)5％乙醇7％乙酸考马斯亮蓝R25020％磺基水杨酸10％三氯乙酸0.25％R250水液10﹪三氯乙酸-10％R25019:1(体积比)5％磺基水杨酸和1％R25019:1(体积比)5min(室温)30min室温)1h(室温)7％乙酸10﹪三氯乙酸90％甲酸考马斯亮蓝G2506％乙酸12.5﹪三氯乙酸6﹪乙酸中1％G25012.5﹪三氯乙酸中0.1﹪G25010min室温)30min室温)甲醇-水-浓氨64:63:1Ponceau3R12.5％三氯乙酸0.1mol/LNaOH中0.1％3R2min室温5％乙醇固绿7％乙酸2h(5℃)7％乙酸范文
6、.7％乙酸中1％固绿氨基萘酚磺酸2mol/LHCL浸几秒钟0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8中0.003％染料3min本实验采用0.05％考马斯亮蓝R250染色液中,含20％磺基水杨酸,其优点是染色固定同时进行,背景易脱色.0.05％考马斯亮蓝R250的20％磺基水杨酸染液:考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100mL,过滤后至试剂瓶内保存.6.脱色液0.1mol/lNaCl溶液7.保存液甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL8.1％琼脂糖溶液琼脂1g,加已稀释10倍的电极缓冲液,加热溶解,4℃贮存备用，使用时取出加热成液体
7、，待稍微冷却后用胶头滴管吸取使用，胶头滴管使用完后立即清洗干净.[实验仪器]夹心式垂直板电泳槽，样品槽模板，直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），烧杯，细长头滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器，水泵或油泵，真空干燥器，培养皿（直径120mm），玻璃板，日光灯一台[实验步骤]一、安装夹心式垂直板电泳槽夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图范文.1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框1.样品槽模板2.长玻璃板4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽3.短玻璃板4.凹形橡胶框7.冷凝系统各部
8、件依下列顺序组装:(1)装上贮槽和固定螺丝，勿使上下贮槽在外连通，使用橡皮管时用
