聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质SeparatingSerumProteinbyPAGE一、目的1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE）,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续体系、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm），

2、然后再进行电泳分离。聚丙烯酰凝胶电泳的过程中有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应，（2）凝胶的分子筛效应，（3）一般电泳的电荷效应。使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用醋酸纤维素薄膜电泳（pH8.6）可以分成5—7个成分，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳则可分成20—30条带清晰的成分。下面就聚丙烯酰胺凝胶电泳说明三种物理效应的原理。1、样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩然后再被分离。（1）凝胶层的不连续性：两层不同的凝胶，其作用如下：浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减

3、的顺序逐渐在其与分离胶的界面积聚成薄层。分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。（2）缓冲液离子成分和电位梯度的不连续性：在浓缩胶中选择pH6.7，电泳槽缓冲液pH为8.3，HCl几乎全部释放出Cl-,甘氨酸（等电点在6.0；羧基解离pKa1=2.34,氨基—NH3+解离pKa2=9.7）在此条件下有极少部分的分子（1—0.1%）解离成为甘氨酸负离子NH2CH2COO-在pH6.7下，大部分蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近于pH5.0）。这三种离子都带有相同电荷，当电泳系统通过一定电流后三种

4、离子同时向正极移动，而且它们的有效泳动率按以下次序排列。（有效泳动率=泳动率m·解离度d）mCldCl>m蛋d蛋>m甘d甘根据有效率泳动率的大小，最快的称为快离子，最慢的称为慢离子，电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳含慢离子，电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，就会很快超过蛋白质，因此，在快离子的后面形成一离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度是成反比的：E（电压梯度）=Ι（电流强度）/η（电导率）所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速运动。当电压梯度和

5、泳动率乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同，（即V=mE）移动速度=（泳动率·电强强度）。在快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间，形成一稳定而又不断向阳极移动的界面。由于样品蛋白质的有效泳动率恰好介于快离子之间，因此也就聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一个狭小的中间层。（3）pH的不连续性：在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在浓缩胶中，慢离子较所有分离样品的有效迁移率低，以样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢

6、离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。2.分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相同的蛋白质分之，也会由于分之筛效应在分离胶中被分开。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。3.电荷效应:蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩

7、，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的条带。在进入分离胶中时，此电荷效应仍起作用。三、实验用品（一）材料兔血清（二）器材1.小烧杯50ml2个2.微量注射器一支3.电泳仪电泳槽胶框各一套4.玻璃板2块5.梳子1个6.吸耳球1个7.染色缸纱布块8.乳头滴管滤纸条滤纸块（三）试剂1.丙烯酰胺储存液单丙烯酰胺22.2克，双丙烯酰胺0.6克，加水至100ml混合后滤纸过滤在棕色瓶中保存。2

8、.分离胶缓冲液取1NHCl48ml，Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.3克，加水至100ml调pH至8.93.浓缩胶缓冲液取1NHCl48ml，Tris5.98克，加水至100ml，调pH至6.74.0.025%溴酚兰5.5%TEMED6.1.5%过硫酸胺7.1.5%琼脂糖溶液8.20%蔗糖溶液9.电极缓冲液取Tris6克，甘氨酸28.8克，加