05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。2．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（Acr）单体和少量交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）和加速剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第2篇第1章）。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径

2、大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用7％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第2篇第1章），使样品分离效果好，分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出5～7条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图3-4），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。图3-4血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为

3、支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为10-2cm的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。【器材】1．电泳仪直流稳压电源，电压400～500V，电流50mA。2．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（5～6mm）,外径7～8mm，长80～100mm的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流（图3-5）。图3-5聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

4、示意图(A为正面，B为剖面)3．大号试管和中号试管4．微量移液器5．5ml注射器和9号注射针头6．洗耳球、滤纸条、封口膜等【试剂】1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺一般性的分析工作，用分析纯的Acr和Bis即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和定量分析，需商品Acr和Bis进行重结晶，进一步纯化。2．N，N，N＇，N＇—四甲基乙二胺（TEMED）商品TEMED即可，低温，避光保存。3．10%过硫酸铵溶液（AP，W/V）10g过硫酸铵定容到10ml，最好使用新鲜配制的溶液。4．染色液取三氯乙酸200g加水500ml，然后加入10g考马斯亮蓝R250用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至1

5、000ml。5．脱色液的配制取三氯乙酸100g加蒸馏水溶解后加至1000ml。6．储备液的配制电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：浓缩胶缓冲液Tris5.98g1mol/LHCl48ml加蒸馏水至100mlPH6.7凝胶储液Acr30.0gBis0.8g加蒸馏水至100ml分离胶缓冲液Tris36.3g1mol/LHCl48ml加蒸馏水至100mlPH8.9凝胶储液Acr30.0gBis0.8g加蒸馏水至100ml10×电极缓冲液Tris6gGly28.8g加蒸馏水至1000mlPH8.3储液配制好后放冰箱4℃冷藏备用，用时10倍稀释，学生用时大约3天需更换一次。7．凝胶液的配制

6、分离胶和浓缩胶的配制见下表：7%分离胶配制（ml）3%浓缩胶配制（ml）双蒸水13.5双蒸水5.7凝胶储液7凝胶储液1PH8.9缓冲液7.5PH6.7缓冲液1.31%TEMED21%TEMED2总体积30总体积108．20%蔗糖100ml取蔗糖20g，加少许蒸馏水溶解，最后加至100ml。9．加样缓冲液的配制(PH6.7)取1mol盐酸4.8ml，Tris0.6g，20%蔗糖溶液40ml，加水至80ml充分混匀后，再加入0.02g溴酚蓝，4℃保存备用。【操作】1．凝胶系统的聚合和制备一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。（1）电泳玻璃管的准备取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素

7、瓶盖的凹穴中或用封口膜密封，备用。（2）分离胶（小孔胶）的制备取分离胶3ml放入试管，加入100μl10%Ap溶液混匀后使用。用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上口2cm时停止（约1.6ml）。注意在加的过程中不要混进空气，用过的注射器和针头要及时用水清洗，防止堵塞。再在其上面小心覆盖0.5cm高的蒸馏水层（约0.2ml）以隔绝空气，并防止柱表面的弯月面。加水过程中不要用力过猛，防止将液