信号转导研究方法.ppt

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1、信号转导通路研究策略和常用方法搞懂信号通路查找文献，了解信号系统的研究进展和热点找到研究点功能分析表达分析如何分析信号蛋白？何时何地表达基因过表达，或基因沉默(细胞水平和整体水平)相互作用蛋白立体论证基因水平转录水平转录后加工翻译水平翻译后加工mRNA和蛋白质降解蛋白质基因表达可以在不同层次上调节基因表达分析方法启动子分析:---EMSA---Reportergeneassay---CHIPassay---NuclearRun-onassay---DNAFoot-printingassay---DNAtrun

2、cationandsite-directedmutagenesis翻译水平分析:---WesternBlots---ImmunocytochemistryImmunohistochemistry---Proteinmodification---Proteomics转录水平分析:---RT-PCR---RealTimePCR---Insituhybridization---Northernblots---RNaseprotectionassay---Primerextentionassay比较转录组学:---D

3、ifferentialscreening---Subtractivehybridization---Differentialdisplay---Array-basedmethods1.蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平检测:Westernblotanalysis.ELISAProteomics信号蛋白分子在细胞内定位研究:Immunohistochemistry/ImmunocytochemistryImmunofluorescence(IF)Greenfluorescentprotein(G

4、FP)-fusionprotein—typically,livecells.印迹技术blotting将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加以检测分析的技术。应用：DNA、RNA、蛋白质的检测DNA印迹:SouthernblottingRNA印迹:Northernblotting蛋白质印迹:Westernblotting又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC膜）,再与溶液中的抗体相互结合的技术。主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特

5、异蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以及蛋白质分子间的相互作用研究等。WesternblottingElectrophoresis转膜ProteinHRPDABH2O21Ab2Ab抽提细胞蛋白，定量聚丙烯酰胺凝胶电泳与特异性抗体杂交。根据标记物特点显色硝酸纤维素膜目的蛋白质抗目的蛋白一抗标记的二抗偶联的碱性磷酸酶磷酸化生色体系脱磷酸显色采用Westernblot方法检测蛋白质原理示意图应用举例某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量相同质量上样，

6、聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹（电转移）杂交（抗体）显色/显影根据显影结果判断：内参目标蛋白检测标本很多的情况下Western无法满足高通量的需求ELISA/Phosphospecific-ELISAs(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)检测蛋白质表达量或者活性状态(化学修饰-磷酸化)比westernblot更快速、更高效.蛋白质组（proteome）：一个基因组所表达的全部蛋白质.蛋白质组学（proteomics)：研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组学(Prot

7、eomics)同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同；在空间和时间上呈动态变化蛋白质组学研究技术平台(高效率,高通量)双向电泳分离样品蛋白质蛋白质点的定位和切取质谱分析第一向：等电聚焦电泳（IEF）第二向：SDS-PAGE电泳免疫荧光技术Immunofluorescence(IF)利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。采用流式细胞免疫

8、荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（DoubleIF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。2.蛋白质与蛋白质相互作用研究技术:Co-IP（免疫共沉淀）withantibodyagainstoneproteinfollowedbyWesternblotwithantibody