实验六细菌的生化试验.doc

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1、.实验六细菌的生化试验目的要求1．通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解；2．掌握常规细菌生化试验操作方法。操作步骤一、糖类发酵（分解）试验原理：细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由兰变黄（指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为兰色。（一）适用于需氧菌的方法培养基用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100

2、ml，pH7.6按0.5～1％的比例分别加入各种糖），每100ml加入1.2ml的0.2％溴麝香草酚蓝（或用1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。如在培养基中加入琼脂达0.5～0.7％，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。0.2％溴麝香草酚蓝溶液配法：溴麝香草酚蓝0.2g0.1NNaOH5ml蒸馏水95ml方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如为半固体，应穿刺），在37℃培养，一般观察2～3天，观察时用上

3、述符号标记之。（二）适用于厌氧菌的方法培养基：蛋白胨20g氯化钠5g琼脂1g1.6％溴甲酚紫酒精溶液1ml糖10g..硫乙醇酸钠1g蒸馏水1000ml将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内，加热使融化，再加入所需的糖，调整pH到7.0，加入指示剂，分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。方法将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37℃培养。结果观察同需氧菌。二、V－P试验（二乙酰试验）原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethylcarbinol）→2，3-丁烯二醇（2，3-b

4、ytaylenecylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。其反应式为：2CH3COCOOH——→CH3COCHOHCH3十2CO2丙酮酸乙酰甲基甲醇CH3CHOHCHOHCH3CH3COCOCH32，3-丁烯二醇丁二酮（二乙酰）培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。方法：1．O’Meara’s法试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，

5、于35～37℃培养48小时，于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。2．Baritt’s法试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。..试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次日不变者为阴性。三、甲基红（M．R．）试验原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成V－P试验中的二乙酰，从而使培养基的pH下降至4.5或以下（V－P试验的培养物pH常在4

6、.5以上），故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V－P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。培养基：同V－P试验培养基。甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95％酒精中，再加入蒸馏水200ml。方法：接种细菌于培养液中，37℃培养2～7天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应。四、淀粉水解试验原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出现透明区。淀粉琼脂培养基：pH7.6的肉浸汤琼脂90ml无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加）5ml无菌3％淀粉溶液10ml将琼脂加热融化

7、，冷却到45℃，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。方法：将细菌划线接种于上述平板上，在37℃培养24小时。生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，观察。结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。五、枸橼酸盐利用试验原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。方法1：Simmons氏培养基：柠檬酸钠lgK2HPO4lg硫酸镁0.2g..氯化钠5g琼脂（洗过）20gNH4H2PO41g1％溴麝香草酚蓝酒精溶液1

8、0ml蒸馏水加至1，000ml调整pH至6.8，15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。将上述培养基中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到培养基中，37℃培养2～4日，培养基变蓝色者为阳性，不变者为阴性。方法2：Christenten氏培养基：柠檬酸钠5g