银耳多糖的制备及一般鉴定.doc

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1、银耳多糖的制备及一般鉴定【实验目的】1.学习真菌多糖类的分离、纯化原理。2.学习多糖类物质的一般鉴定方法。3.掌握真菌多糖类粗提取的具体步骤及相应原理。【实验原理】银耳是我国传统的-•种珍贵药用真菌，具有滋补强壮、扶正固本之功效。银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。提取与纯化动植物中存在的多糖或微生物胞内多糖，因其细胞或组织外大多冇脂质包围，要使多糖释放出來，笫一步就是去除表脂质，常用醇或储回流脱脂。笫二步将脱脂后的残渣以水为主体的溶液提取多糖，这样提取得到的多糖提取液

2、含有许多杂质。杂质上要是无机盐，低分子量的有机物质及高分子量的蛋白质、木质素等。第三步则要除去这些杂质,对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化（如蛋白酶.木质素酶），乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。多糖提取液中除去蛋白质是一个很重耍的步骤，常用方法有Sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。（1）Sevage法是除蛋口的经典方法，主要是利用蛋口质在氯仿中变性的特点，用氯仿:正丁醇=5:1或4:1的二元溶剂体系按1:5加入到多糖提取

3、液中，混合物经剧烈振摇后离心，蛋白质与氯仿-正丁醇牛成凝胶物而分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。（2）三氯乙酸法利用三氯乙酸，在低温下搅拌加入到多糖提取液中，直到溶液不再继续混浊为止离心弃沉淀，即可达到脱蛋白的目的。存在于溶液中的三氯乙酸经中和后，通过透析或超滤等方法除去。（3）酶解法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专-•性的特点，选择相应的酶，将细胞舉的组成成分（纤维素、半纤维素和來胶质）水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂屮，从而达到提取目的，且有利

4、于提高成分的提取率。（4）三氟三氯乙烷法将三氯乙烷按1:1的比例加到多糖提取液中，在低温下搅拌约lOmin,离心得上层水层，水层继续用上述方法处理儿次即得，此法效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用。本实验采用固体法培养获得的银耳子实体，经沸水抽提、三氯甲烷一正丁醇法除蛋白质和乙醇沉淀分离可制得银耳多糖粗品。然后进行定性和定量测定及杂质含量测定。【实验方法】1.提取1.1银耳5g,剪碎,放入1000ml烧杯中。加500ml蒸憾水，加一匙NaHC03（可加速溶化）,沸水提取l・5h,同时搅拌。提取过程中可以少

5、量加水。1.2三层纱布过滤，得提取液（约200ml）0将提取液移至分液漏斗中。1.3向提取液中加1/4体积的氯仿:正丁醇溶液（V:V=4:1）o振摇15min,离心（5min）。离心灰，溶液分为三层，吸取最上层清液，得到去蛋白的多糖液。1.4向去蛋白的多糖液加3借体积的95%乙醇，玻棒搅拌既得多糖沉淀。1.5用乙醇和丙酮分別洗涤沉淀，干燥，得粗提取物。2.含量测定（未做）称得样品总质量，配置样品溶液O.lmg/ml,并按下表操作编号12345678标准银耳多糖溶液00.10.20.30.40.5样品银耳多

6、糖溶液0.50.5水10.90.80.70.60.50.50.5硫酸恵齣44444444完成以上操作后，将各试管放入沸水中煮lOmin,然后冷至室温。在490nmF,测定吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品多糖的浓度。另外以Folin酚法测定银耳多糖样品中蛋白质含量，以紫外分光光度法测定样殆中核酸的含量。【讨论】实验中，我们首先用沸水提収银耳多糖，并在水中加入一匙碳酸氢钠。加入少量碱是因为对于银耳多糖这种含有糖醛酸的中性多糖，它们在碱液中有更高的提取率，但要控制碱的浓度，碱性较强时多糖可能会水解。在

7、沸水煮银耳提取多糖的1.5小时内，要不停搅拌提取液，以防底部银耳碎片粘于烧杯底部变糊，同时可适量补充水分。得到银耳多糖的胶体溶液后，用三层纱布过滤可去除人分子溶质从而纯化多糖提収液（黄色透明液体，约200ml）o用Sevage法除蛋口，将氯仿：止丁醇溶液与提取液充分混匀，以使提収液中的蛋口质成分与氯仿：正丁醇溶液充分接触而生成凝胶物，不断振摇分液漏斗后，液体变为白色的乳状液，而不分层。离心混介液后，可能是因为离心时间不够充分（离心5min）,溶液较为清晰的分成了3层，但在多糖层和蛋白层ZlnJ,还冇变形的

8、、未完全沉淀的蛋白质杂质。取离心后的上层清液加入95%乙醇后，搅拌即nJ得乳白色多糖沉淀。用乙醇和丙酮洗涤多糖沉淀可除去一些大分子杂质，但在洗涤时，由于对多糖沉淀搅拌较重，沉淀团块被打碎，有部分多糖损失。倒去洗涤液，我们得到了乳白色的多糖团块。最后，感谢老师为我们提供了这次学习、实践的机会，感谢您们利用周末时间帮助我们完成实验。