荧光法测定药片中维生素B2含量.ppt

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1、荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量授课单位：化学与生命科学学院授课课程名称：仪器分析实验教师：陈志兵荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量实验目的学习荧光分光光度法测定药片中维生素B2的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素B2的方法。掌握Origin绘图软件的使用方法实验原理荧光分析法常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。实验原理荧光分析法在稀溶液中，荧光强度I

2、F与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。荧光分析法的特点激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。荧光光谱激发光谱发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线

3、。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。荧光光谱发射光谱荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：液槽显示器单色器检测器I0IIf光源单色器荧光分析仪器荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。a.光源：在荧光计中常用卤

4、钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。仪器部件维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。药液维生素B2含量的测定维生素B2溶液在430～480nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525nm。VB2的荧光在pH

5、=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。光黄素实验预习预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理。了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2的方法。F-4500型荧光光度计（日本日立公司）10mL具赛试管10只，移液枪1只，100mL容量瓶2只5×10-5g·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），药用VB2试样(5×10-4g·mL-1)仪器与试剂1.打开计算机，先

6、接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下XeLAMP按钮，再接通主开关（MAIN），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。3.样品测定。4.关机顺序：逆开机顺序实施操作。基本操作1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在10个干净的10mL具赛试管中，分别吸取25、50、75，100、125、150、175、200uLVB2标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。实验步骤2.未知

7、试样的测定:在两支10mL具赛试管中，分别移取100uL试样,用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。实验步骤1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB2含量。数据处理1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？注意事项和问题1、 波长扫描（Wavelength Scan） 对样品进行激发波长或发射波长的扫描。点击快捷栏“Method”,显示出“A

8、nalysisMethod”的五个命令，分别为General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理方法)、Report(报告格式)，输入相应数据。附录：仪器操作软件有关说明1.1 GeneralMeas