荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量

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1、荧光光度分析法1一、基本原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的光--------荧光。以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。1.荧光的定义2假设分子在吸收辐射后被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于较高振动能级上的分子，很快地（约10-12~10-14s）发生振动松驰，将多余的振动能量传递给介质而降落到该电子的最低振动能级（V=0），后经由内转化及振动松驰而降落到S1电子态的最低振动能级，处于S1电子态的激发分子，其分子内的去活化作用有如下三种途径：2.分子产

2、生荧光的机理3（1）发生S1→S0的辐射跃迁而伴随荧光现象；（2）发生S1→S0的内转化过程；（3）发生S1→T1的体系间窜跃。而处于T1态的最低振动能级的激发分子，则可能发生T1→S0的辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能发生T1→S0的体系间窜跃。4v=0iscT1v=0v=02112231VRVRVRiscv=0S1S2S012PicFA1A2ic分子内的光物理过程A1、A2.吸收F.荧光P.磷光ic.内转化isc.体系间窜跃VR.振动松弛56式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。3.荧光强度与浓

3、度的关系对同一物质而言，若abc<<1（＜0.05或0.03），即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：F=2.303ФfI0a•b•c式中：Фf－荧光过程的量子效率；I0－入射光强度；a－荧光分子的吸收系数；b－试液的吸收光程。I0和b不变时：F=K•C7图A为一极稀的溶液，在入射光I0照射下所发生的荧光均匀地分布在液池中；图B为较浓的溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而发生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体，则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光强度反而更低。

4、4.偏离线性关系的原因⑴内滤效应8I0ItF图AItI0F图B内滤效应示意图返回9在浓度较高的溶液中，可能发生溶质与溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的复合物或荧光物质的激发态分子与其它溶质基态分子的复合物，从而导致荧光强度的下降。在浓度更大时，甚至可能产生荧光物质基态分子的聚集体，导致荧光强度更严重的下降。⑵激发态分子与基态分子或其它溶质分子形成复合物，甚至产生荧光物质基态分子的聚集体10假如荧光物质的吸收光谱与它的荧光光谱呈现重叠，便可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象，从而造成荧光强度下降。在这种情况下，

5、浓度增大时会促使再吸收现象的加剧。⑶由于再吸收（自吸）现象11二、VarianCaryEclipse荧光分光光度计的特点由于荧光物质的荧光强度与激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预热、耗能12W但脉冲输出能量却高达75KW的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光分析者带来极大的方便.1.硬件及硬件的主要特点⑴高能闪烁光源-----氙灯12①可以开着样品室测量由于室内光线的强度不足激发光源的千分之一，不会对测量造成干扰，因此省去了反复开盖、关盖的繁琐。这一特点尤其方便在反应动力

6、学测量过程中往液池内添加反应试剂。②有效避免光敏物质的降解传统的连续Xe灯光源开机后一直处于发射状态，许多荧光物质在其长时间的照射下会发生降解，引起测量误差。而Eclipse通过自定义闪烁次数或闪烁时间，既保证了足够的激发，以避免了光降解作用。③大大延长了Xe灯光源的使用寿命Xe灯可连续工作20,000小时，远长于普通连续Xe灯的500~2,000小时，基本上终生不用更换光源。13由于荧光分析测量的是分子的绝对发光强度，背景荧光和散射光的干扰越低，灵敏度就越高。Eclipse为有效克服这些干扰，在其激发和发射单色器上都配置了多波长范

7、围的滤光片，一旦选定测量波长，软件可自动调用合适的滤光片。⑵可自动调用的多波长范围滤光片（标准配置）14一支用于样品信号的测量，一支用于参比信号。这种红敏的光电倍增管在紫外至红外1100nm的波长范围内都具有良好的灵敏度，同时还可以通过软件调整光电倍增管检测电压（强荧光测量用低电压，弱荧光用高电压），在保证合理灵敏度的同时，最大限度地延长其使用寿命，与长寿命光源相匹配，共同确保Eclipse的整机使用寿命。⑶两支R928型光电倍增管（标准配置）15减少了测量所需的样品体积（标准10mm液池仅需0.5mL样品）。同等条件下，由于检测到

8、的样品体积比垂直狭缝大得多，因此，Eclipse的灵敏度比传统垂直狭缝设计高出5~30倍。⑷水平狭缝16仪器内部结构示意图17仪器光路示意图闪烁Xe灯狭缝反光镜光栅激发单色器发射单色器滤光片反光镜棱镜光电倍增管（参比信号）液池光电倍增