荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素b2的含量

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1、荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量姓名：周蕴赟学号：40507026（2005级4班Email:zyy1021@stu.snnu.edu.cn） 一、实验目的1、学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理；2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。二、实验原理：常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强

2、度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。荧光分析法的特点：a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。荧光光谱激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出

3、最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：液槽显示器单色器检测器I0IIf光源单色器维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430～440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。多维葡萄糖中

4、含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。三、试剂与仪器:970CRT荧光光度计5ml吸量管1只，2ml吸量管1只，50ml容量瓶6只,100ml容量瓶1只10.0μg/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸，多维葡萄糖粉试样。四、实验步骤:（一）、970C

5、RT荧光光度计基本操作：1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：设置激发波长为440nm，发射波长为540nm，灵敏度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。3、点击“测本底值”，测得本底值为1.41。4.样品测定1）标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：   在6个干净的50ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2

6、，0.3，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2）未知试样的测定：称取0.1378g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入100ml容量瓶中，加2.00ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。5、退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。五、数据处理：1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线浓度(μg/ml)荧光强度(I)123平均0.14.3234.3074.2984.3090.27.3807.3297.3407.3500.39.8409.8019.7909.8100.412.

7、02012.03311.97612.0100.514.67814.78114.74414.7340.617.08817.09117.09017.0902、未知样品浓度的测定                根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。编号123平均值I7.1777.2027.1277.177C/ug.ml-10.2030.2040.2010.203维生素B2百分含量=(0.203×50×10-6)/0.1378×100％=0.0074％六、注意事项1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作。2.