动保中心鸡血凝血抑实验.ppt

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1、动保中心血凝（HA）与血凝抑制（HI）报告人：陈雪梅、张俊部门：动保中心时间：2012-2-12主要内容：一、实验原理二、实验材料五、实验方法与结果判定六、举例说明七、注意事项化验室是生产技术部一部分，和生产密切相关。我们主要负责各养殖场场鸡群的抗体检测工作。主要抗体检测：血凝抑制试验抗体是鸡群接触抗原（包括疫苗和有害病原微生物）体内产生的特异性蛋白质。他能很好反映机体的感染或抵抗状况1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。病毒颗粒红细胞2、血凝抑

2、制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。抗体抗原Iamlate！3、抗原：凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体结合而发生特异反应的物质称为抗原。4、抗体：是机体受到抗原物质刺激产生的具有特异性的免疫球蛋白，它能与相应的抗原结合，发生特异性反应，并具有一定的消除病原微生物及其产物的物质。适用范围：适用于对鸡新城疫(ND)，禽流感(H9、H5-4、H5-5)抗体滴度的检测。

3、材料准备离心机（离心红细胞和离心血清）冰箱（存放抗原和血清）振荡器（振荡96孔V型板）抗原：新城疫（ND）、流感（H9、H5-4、H5-5）抗原（从指定厂家买稳定的浓缩抗原）1%红细胞悬液、PBS液（做血清稀释液用、配制4单位抗原）离心管和离心盒（保存血清）96孔V型板(稀释血清)单道、八道移液器、十二道移液器和枪头（加样、稀释血清）积液巢（盛PBS液及配制4单位抗原）附录1PBS液配制准确称取NaCl24g、Na2HPO48.7g、KCl0.6g、KH2PO40.6g，加蒸馏水至3000mL，加热溶解后调pH值至7.2，121℃高压灭菌15mi

4、n，4℃保存备用。附录21%鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积PBS液混合，将混合液10ml装入带刻度离心管，配平后放入离心机中，经2000r/min，离心4min。用吸管吸去上清液与白细胞、弃去，将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复离心三次，第四次离心时2500r/min，离心5min，将最后一次离心后的红细胞泥，按1%的稀释度加入PBS液中稀释，4℃保存备用。血凝（HA）试验采用96孔V型反应板，测定抗原效价1、首先用微量移液器向反应板的每孔加PBS液30微升。2、用微量移液器吸取待测抗原3

5、0微升于第一孔中并挤压6-7次混合，之后吸出30微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔、弃去30微升。12孔为红细胞对照孔。每种抗原4个平行对照。3、用微量移液器再向反应板的每孔加PBS液30微升。4、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔30微升。5、置于微量振荡器上振荡10--30秒。6、室温静置40分钟后观察结果。1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×红细胞对照PBS液303030303030303030303030抗原3030303030303030303030弃去3

6、0红细胞303030303030303030303030结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－操作示意图结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞平铺孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。血凝实验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑

7、制实验所用病毒的稀释倍数（抗原单位）4单位抗原校正1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。例：上图1抗原效价为1：256，HI试验时，30微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升PBS液。2、首先用微量移液器向反应板的第1孔至第5孔加生理盐水30微升。3、用微量移液器吸取4单位抗原30微升分别加入第1孔中，从第1孔开始挤压6-7次混合，后吸出30微升至第2孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去30微升。4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-5孔，每孔30微升。5、

8、于微量振荡器上振荡10~30秒。6、室温静置40分钟后观察结果。7、结果观察：第1、2孔为完全凝集，第3孔红细胞为50%沉