分子生物学原理基因工程.ppt

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1、第十四章基因重组与基因工程8/8/2021分子生物学原理基因重组：genomicrecombination重组DNA：recombinantDNA8/8/2021分子生物学原理第一节、自然界的基因重组转化：transformation整合：integration转导：transduction转位：transposition8/8/2021分子生物学原理转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化8/8/2021分子生物学原理转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细

2、胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化8/8/2021分子生物学原理整合整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的DNA注入菌体中。此DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新噬菌体，并将细菌涨破。8/8/2021分子生物学原理整合溶原和裂解可以相互转变。8/8/2021分子生物学原理转导溶原菌中DNA可以原样地切离

3、出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。8/8/2021分子生物学原理转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。8/8/2021分子生物学原理转位8/8/2021分子生物学原理第二节、基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或

4、重组DNA技术。分子水平上操作，细胞水平上表达。赋予重组DNA以新的生命力。8/8/2021分子生物学原理基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。转入GnT-Ⅴ基因肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义GnT-Ⅴ基因转移转移8/8/2021分子生物学原理基因克隆分切接转筛8/8/2021分子生物学原理载体和目的基因载体：vector在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一

5、步的基因表达能力。常用的载体有：质粒、噬菌体、M13噬菌体逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。8/8/2021分子生物学原理质粒质粒：plasmid环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。8/8/2021分子生物学原理质粒pBR322：常用的质粒8/8/2021分子生物学原理噬菌体载体噬菌体、M13噬菌体易于感染大

6、肠杆菌噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。一个切口：插入型载体。二个切口：置换型载体。8/8/2021分子生物学原理噬菌体载体8/8/2021分子生物学原理目的基因的来源直接从染色体DNA中分离：原核生物人工合成：简单的多肽从mRNA合成cDNA：真核生物基因文库：(genelibrary）G文库：用基因组的全部DNA制备。c文库：用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。8/8/2021分子生物学原理从mRNA合成cDNA8/8/2021分子生物学原理限制性内切酶的应用限

7、制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构回文结构：palindromeDNA双链具有方向相反顺序一致的结构。平端：bluntend在同一水平上切断两条链。(钝型末端)粘性末端：stickyend碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。8/8/2021分子生物学原理限制性内切酶的应用AluI….AGCT…..….AGCT...平端…..TCGA…..….TCGA...BamHI…GGATCC…...GGATTC…粘性...CCTAGG……CCTAAGG…末端8/8/2021分子生物学原理限制性内切酶的应用切载

8、体切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两者相连要点：避免切断目的基因8/8/2021分子生物学原理载体和目的基因的连接人工连接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。连接方式：粘端连接方式尾接法8/8/2021分子生物学原理粘端连接8/8/2021分子生物学原理尾接法8/8/2021分子生物学原理重组体的转化基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程