酶分子修饰ppt课件.ppt

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1、第四章酶分子修饰前言：酶分子经过修饰以后，可以显著提高酶的使用范围和应用价值。酶分子修饰成为酶工程中具有重要意义和应用前景的领域。本章主要介绍酶分子修饰的基本原理、方法与修饰酶的特征。酶工程第一章酶学概述第二章酶的生产第三章酶的分离纯化第四章酶分子修饰第五章酶、细胞、原生质体固定化第六章酶反应器第七章酶的应用酶的生物改造（定向进化）略酶的化学修饰酶的化学修饰基本原理方法学应用一、酶分子修饰的概念通过各种方法使酶分子结构发生改变，从而改变酶的某些性质和功能的过程，称为酶分子修饰。第一节酶分子修饰的基本原理二、酶分子修饰的原理酶分

2、子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子，酶分子的完整结构决定了酶的性质（催化效率高，专一性强和作用条件温和等）和生物催化功能。当酶分子的结构发生改变时，将会引起酶的性质和功能的改变。三、酶分子修饰的目的①提高酶的活性；②增强酶的稳定性；③降低或消除酶的抗原性；④探讨酶结构与功能之间关系。第二节酶分子修饰的方法酶分子修饰技术不断发展，修饰方法多种多样。酶分子修饰主要包括：金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰等。一、金属离子置换

3、修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。金属酶：即含有金属离子的酶，金属离子在酶中主要有结构功能和催化功能。金属酶种类繁多，如：Fe、Zn、Cu、Mn、Mo、Co、Ni等。金属离子在相应的金属蛋白中有一定数目的原子参与活性，金属与邻近的非金属原子（S、O、N等）配位一起构成辅基，并与蛋白结合发挥出独特的催化功能，估计在全部已知的酶中大约1/4～1/3都要求具备金属离子的活性中心。（一）、金属离子置换修饰的方法⑴酶的分离纯化：首先获得一定纯度的酶。⑵除去原有的金属离子：利

4、用螯合剂（EDTA等）与金属离子形成螯合物，再通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将螯合物除去。⑶加入置换离子：加入另一种金属离子。常用的金属离子一般为：Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Fe2＋等二价金属离子。（二）、金属离子置换修饰的作用1、阐明金属离子对酶催化作用的影响2、提高酶的活力例如：α－淀粉酶，是杂离子型的。将其他的杂离子换成钙离子，则可以提高酶活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α－淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α－淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大增加。3、增强酶的稳定性例如：F

5、e－SOD分子中的铁离子被锰离子置换，成为Mn－SOD后，其对过氧化氢的稳定性显著增强。对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。4、改变酶的动力学特性例如：用钴离子置换酰基化氨基酸水解酶的活性中心的锌离子，其催化N－氯－乙酰丙氨酸水解的最适pH值从8.5降低为7.0。同时该酶对N－氯－乙酰丙氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。二、大分子结合修饰采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。目前应用最为广泛的酶分子修饰方法。（一）、大分子结合修饰的方法1、修饰剂的

6、选择一般为水溶性大分子。如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、蔗糖聚合物（ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。相对分子质量为1000～10000的PEG被广泛应用。2、修饰剂的活化聚乙二醇修饰蛋白质主要通过聚乙二醇的末端羟基与蛋白质的氨基酸残基反应而实现，但聚乙二醇的末端羟基活性很差，很难在温和的环境中与蛋白质进行偶联反应，所以必须使用活化剂活化该羟基，使活化的聚乙二醇能在温和的环境中对蛋白质进行共价修饰。近年来聚乙二醇的活化方法已成为该领域的研究热点之一。例如，常用的大分子修饰剂单甲氧基聚乙二醇（MP

7、EG）可以采用多种不同的试剂制备聚乙二醇衍生物：①聚乙二醇均三嗪衍生物：MPEG的羟基与均三嗪(三聚氯氰）可制得MPEG1和MPEG2。后者分子上的活泼氯离子可以对天冬酰氨酶等酶分子上的氨基进行修饰。②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：MPEG的羟基与琥珀酰亚胺反应，生成SS-MPEG、SSA－MPEG、SC-MPEG等衍生物。这些衍生物可以在pH7~10的条件下对酶分子的氨基进行修饰。MPEG琥珀酸亚胺碳酸酯羟基琥珀酰亚胺活化与偶联反应原理图生成MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯③聚乙二醇马来酸酐衍生物：与马来酸酐反应生成PM。可通过马来酸酐

8、对酶分子上的氨基进行修饰，形成酰胺键。这些蜂窝巢型修饰剂在酶分子表面覆盖上阴离子基团。④聚乙二醇氨类衍生物等：MPEG的羟基与胺类化合物反应，生成的聚乙二醇胺类衍生物，可以对酶分子上的羰基进行修饰。3、修饰将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定