《酶分子的修饰》PPT课件

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1、第五章酶分子修饰定义:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，进而改变酶的某些功能和特性的技术。酶分子非必需基团必需基团活性中心必需基团活性中心外必需基团结合基团催化基团非活性中心活性中心与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团一、酶分子修饰的目的(1)提高酶活力：酶蛋白与大分子修饰剂交联后，修饰剂产生的空间障碍或静电斥力可能有效阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护了酶活性部位，使抑制剂和酶活性部位结合的难度增加。(2)增强酶的稳定性：许多修饰剂分子存在多个活性反应基团，常常可以与酶形成

2、多点交联，使酶分子的天然构象不容易伸展打开，同时减小酶分子内部基团的热振动，增强酶的热稳定性。一、酶分子修饰的目的(3)降低或消除酶的抗原性：酶分子结构上有一些aa残基组成的抗原决定簇，进入机体后，就会诱发产生抗体，使酶失活，通过酶的修饰，有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏酶分子上的抗原决定簇结构，使酶的抗原性降低甚至消失。(4)探索酶的结构和功能的关系：通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，探讨酶的结构和功能的关系。二、选择酶分子修饰剂特性：(3)被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离出来并鉴定。(4)反应程度

3、能用简单的技术测定(1)能选择性地与一个aa残基反应。(2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行。修饰剂的要求：相对分子量较大；生物相容性和水溶性好；表面反应活性基团较多；修饰后酶活的半衰期较长；三、选择反应条件修饰反应总是尽可能在酶稳定的条件下进行，尽量少破坏酶活性功能的必需基团，反应的最终结果是要得到酶和修饰剂的高结合率及高酶活回收率。pH是最重要的增加pH提高反应速率降低pH减小反应速率反应活性高的修饰剂pH在生理状态下反应活性较低的修饰剂需要较高的pH酶的化学修饰酶分子内部修饰金属离子置换修饰大分子结合修饰酶蛋白侧链基团修饰氨基酸置换修饰肽链有限水解修饰物理修饰核酶的修饰核苷酸链剪切修饰

4、核苷酸置换修饰酶的化学修饰酶分子内部修饰金属离子置换修饰大分子结合修饰酶蛋白侧链基团修饰氨基酸置换修饰肽链有限水解修饰物理修饰核酶的修饰核苷酸链剪切修饰核苷酸置换修饰第一节金属离子置换修饰一、定义：把酶分子中的金属离子换成另外一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。关键所在用于修饰的金属离子，一般都是二价金属离子：如Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+等二、作用范围含有金属离子的酶金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可

5、使酶呈现不同特性。三、金属离子置换修饰的过程1、酶的分离纯化2、除去原有的金属离子3、加入置换离子将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得一定纯度的酶液。在纯化后的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如EDTA等，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将螯合物从酶液中除去，此时的酶液呈无活性状态。加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合后，除去多余的置换离子。三、金属离子置换修饰酶的作用1、阐明金属离子对酶催化作用的影响：了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，从而有利于阐明酶的催化作用机制。2、提高酶活力：一般α—淀粉酶是杂离子型，即分子中大

6、多数含有Ca2+，有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子，如果将其他杂离子都换成Ca2+，则可以提高酶活力，并显著提高酶的稳定性。三、金属离子置换修饰酶的作用3、提高酶的稳定性4、改变酶的动力学特性：Km、Vm、pH、温度等。有的可以使酶活性降低甚至丧失，有的却可以使酶活力提高或增加酶的稳定性。第二节大分子结合修饰一、定义：利用水溶性的大分子与酶蛋白的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。目前应用最广泛的酶分子修饰方法二.修饰剂：要求：具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期较长，活力回收较高。聚乙二醇（PEG）、右旋糖

7、酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。[HO—CH2—CH2—O—CH2—CH2—OH]n(1)PEG分子量为1000一10000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好。(2)溶解度高，溶于水，也溶于有机溶剂，没有抗原性，也没有毒性，生物相容性好。聚乙二醇三、修饰：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。1、修饰剂的活化以PEG为例，PEG的羟基被活化，