GBT28062-2011柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16蝠园中华人民共和国国家标准GB／T28062--201柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法DetectionofCandidatusLiberibacterasiaticususingthereal—timefluorescentPCR2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鹳鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会锚19刖昌GB／T28062--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：重庆大学、农业部农业技术推广服务中

2、心、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：殷幼平、王中康、王玉玺、高文娜、夏玉先、曹月青、彭国雄、李正国。1范围柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法GB／T28062--2011本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibaeterasiatieus)实时荧光PCR检测的样品制备、检测操作方法及结果判定标准。本标准适用于对芸香科和非芸香科植物罹病植株和传播媒介柑桔木虱中黄龙病亚洲韧皮杆菌的检测和病害鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引

3、用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB5040柑桔苗木产地检疫规程GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3．1柑桔黄龙病CitrusHuanglangbing一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑桔属、金柑属和枳属等柑桔类植株重。由带菌种苗远距离传播，田问主要由柑桔木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝梢黄化，果实畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡。3．2实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的

4、方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。3．3扩增引物primer人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3．4扩增模板templetDNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。3．5ct值cyclethresholdvalue实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3．6亚洲韧皮杆菌重组质粒DNArecombinantplasmidDNA利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板，获得的亚洲韧皮杆菌特异性

5、DNA扩】GB／T28062--2011增序列，经构建重组质粒、转入大肠杆菌JMl09菌株中繁殖培养后，重新提取获得的质粒DNA。用于作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测的阳性对照。4柑桔黄龙病菌基本信息学名：亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacterasiaticus。病害名称：柑桔黄龙病，常用英文名：CitrusHuanglongbing。分类地位：一朊细菌亚纲、根瘤细菌目(Rhizobiales)，根瘤细菌科(Rhizobiaceae)，韧皮杆菌属Liberibacter的G一细菌。是一种难培养细菌。引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖

6、体基因序列的差异可以分为3种，即分布于非洲的柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacterafricanus，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Can—didatusLiberibacteramericanus和分布于亚洲及北美的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberi—bacterasiaticusJagoueixetal。柑桔黄龙病菌其他信息参见附录A。本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法。对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验，可参见附录B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌；对来自美洲的柑桔材料，除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮

7、杆菌外，可参见附录c检测柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌。5方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物一DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TaqDNA聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基

8、团游离出来并发出荧光信号