GBT28068-2011-柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

《GBT28068-2011-柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS65．020．01B16a亘中华人民共和国国家标准GB／T28068--201柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法DetectionofXanthomonascitrisubsp．citriusingthereal—timefluorescentPCR2011-12-30发布2012-06-01实施丰瞀徽鬻瓣警糌瞥篓发布中国国家标准化管理委员会促19标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T28068--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：重

2、庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王中康、殷幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法GB／T28068--2011本标准规定了柑桔溃疡病菌(Xanthomonascirrisubsp．cirri，Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制备、检测技术、操作方法及结果判定标准。本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的

3、版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB5040柑桔苗木产地检疫规程GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3．1柑桔溃疡病citruscankerdisease由柑桔溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害。症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面出现隆起的木栓化溃疡病斑，造成柑桔落叶落果、树势衰弱，严重影响柑桔产量与果品外观质量。3．2柑桔溃疡病菌Xanthomonuscitrisubsp．cirri指引起亚洲型柑桔溃疡病的病原细菌，为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新

4、组合(Schaad2006；Young2008)。3．3实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。3．4扩增引物primer人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3．5扩增模板templetDNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。3．6Ct值cyclethresholdvalue实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

5、标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28068--20113．7柑桔溃疡病菌重组质粒利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌(Xanthomonascirrisubsp．citri)基因组模板，获得的柑桔溃疡菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照。4柑桔溃疡病菌基本信息拉丁学名：柑桔黄单胞茵柑桔亚种Xanthomonascitrisubsp．citriGabrielet．al(1989)。病害名称：柑桔溃疡病citruscancerdisease。

6、分类地位：假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas，柑桔黄单胞Xanthomonascitri[Gabrielet．al(1989)]。主要分布于亚洲的中国，印度和东南亚，美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区。葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和枳等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要途径；田间则主要由夹风雨和农事操作传播。柑桔溃疡病菌其他信息参见附录A。利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对XccF05／XccR05，以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和褐色黄单胞莱檬亚种(BC／

7、D菌系)(检测引物、检测方法及结果判定参见附录B)。5方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物一DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TaqDNA聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报