细胞生物学常用技术原理与应用.pdf

细胞生物学常用技术原理与应用.pdf

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1、细胞生物学常用技术原理与应用安云鹤2016.7.2一、细胞计数方法二、细胞活力测定三、细胞冻存复苏四、克隆形成实验五、侵袭转移实验六、划痕愈合实验七、细胞凋亡检测八、细胞周期测定九、免疫细胞化学十、细胞转染实验一、细胞计数方法悬浮及半悬浮细胞半悬浮生长细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用吸管直接吹打使细胞从瓶壁脱落下来。贴壁细胞计数设备血细胞计数板血细胞计数仪计数方法将血球计数板及盖片擦拭干净,将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静臵3min。镜下观察计算计

2、数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。计数方法按如下公式计算镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算;若细胞团占10%以上,需重新制备细胞悬液。二、细胞活力测定总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。细胞活力的测定是细胞体外研究中应用最广的技术手段之一。组织中分离细胞及细胞复苏常需要检查活力。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成,很难从形态上区别死、活细胞。常用噻唑蓝比色(MTT)法、台盼蓝法。MTT法活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶产物forma

3、zan(甲瓒),并沉淀在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解沉积的甲瓒,溶液颜色深浅与其含量成正比,可用酶标仪测定OD值。MTT法广泛应用于新药筛选、细胞毒性、肿瘤放射敏感性实验等。台盼蓝法将细胞悬液与等量的0.4%台盼蓝染液混合,染色2-3min。镜下可见死细胞被台盼蓝染成深蓝色,活细胞不被染色呈无色透明状。细胞活力测定须与细胞计数合并进行,但要考虑染液对细胞悬液的倍比稀释。三、细胞冻存复苏细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以节省人力、经费,减少污染和细胞生物学特性变化。

4、冻存复苏的原则:慢冻快融技术原理当细胞冷至0℃以下时,细胞器开始脱水,细胞中可溶性物质浓度升高并析出,在胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,胞内不致产生大的冰晶,否则会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融,目的是避免胞内重新形成冰晶。技术原理在细胞冻存时应加入低温保护剂。常用的低温保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。DMSO是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,降低冰点,延缓冻结过程;并提高胞膜对水的通透性,使胞内水分在冻结前析出胞外,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。冻存方法预先配制冻存液:

5、70%培养基+20%血清+10%DMSO。胰酶消化对数生长期细胞,经离心弃上清后加入适量冻存液吹打成细胞悬液(1-5×106个/ml)。细胞悬液按规格加入至冻存管中,密封后标记细胞名称、研究者姓名和日期。4年内存活率最高可达80%以上。冻存方法标准程序冻存管臵于程序降温盒中,放入-80℃冰箱,次日转移至液氮中长期保存。冻存管臵于程序降温仪中,先设定按1-2℃/min降温,达到-25℃以下时再按5-10℃/min降温,达到-100℃时可迅速转移至液氮中。冻存方法简易程序冻存管首先臵于4℃,约40min。之后臵于

6、-20℃,约30-60min。再臵于-80℃中放臵过夜。最后臵于液氮罐中长期保存。冻存方法快冻程序冻存管(管口要朝上)放入纱布袋内,纱布袋系以线绳。通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口,按1-2℃/min速度降温,在30-40min内降至液氮表面,停30min后直接投入液氮中。复苏方法从液氮中取出冻存管,迅速投入37℃水浴并不断摇晃,使管中的液体快速融化。在5min内将细胞悬液转移至培养瓶内,补充适量的预热的新鲜培养液。四、克隆形成实验平板克隆形成适用于检测单个贴壁生长细胞形成克隆的能力,从而反应细胞增殖状况。

7、对于肿瘤细胞来说,克隆形成能力越高则反应其恶性程度越高。两个指标反应细胞增殖能力:①克隆形成率;②克隆大小。平板克隆形成每平皿(D=60mm)接种100-200个细胞,补加培养液至10ml,≥3平皿/组。十字形晃动使细胞分散均匀,常规培养2-3周(当出现肉眼可见的克隆时终止培养),弃培养液,PBS洗涤2次。甲醇固定15min,姬姆萨染色20min,自来水冲洗,空气干燥。计数肉眼可见的克隆数。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。平板克隆形成平板克隆形成必须选择对数生长期细胞。计数要准确,至少三遍,取平

8、均值。在接种细胞时,细胞数避免过多,否则会出现细胞克隆融合并给计数带来麻烦,同时一定要使细胞分散均匀。一般情况下,接种200个细胞时,10ml培养液足够支撑3周,中间不必换液,主要注意防止污染。软琼脂克隆形成原适用于非贴壁生长细胞,但某些恶性肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能增殖,在悬浮状态下也能增殖,其

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