细胞生物学常用技术原理与应用.pdf

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1、细胞生物学常用技术原理与应用安云鹤2016.7.2一、细胞计数方法二、细胞活力测定三、细胞冻存复苏四、克隆形成实验五、侵袭转移实验六、划痕愈合实验七、细胞凋亡检测八、细胞周期测定九、免疫细胞化学十、细胞转染实验一、细胞计数方法悬浮及半悬浮细胞半悬浮生长细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用吸管直接吹打使细胞从瓶壁脱落下来。贴壁细胞计数设备血细胞计数板血细胞计数仪计数方法将血球计数板及盖片擦拭干净，将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静臵3min。镜下观察计算计

2、数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。计数方法按如下公式计算镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算；若细胞团占10%以上，需重新制备细胞悬液。二、细胞活力测定总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。细胞活力的测定是细胞体外研究中应用最广的技术手段之一。组织中分离细胞及细胞复苏常需要检查活力。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，很难从形态上区别死、活细胞。常用噻唑蓝比色（MTT）法、台盼蓝法。MTT法活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶产物forma

3、zan（甲瓒），并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解沉积的甲瓒，溶液颜色深浅与其含量成正比，可用酶标仪测定OD值。MTT法广泛应用于新药筛选、细胞毒性、肿瘤放射敏感性实验等。台盼蓝法将细胞悬液与等量的0.4%台盼蓝染液混合，染色2-3min。镜下可见死细胞被台盼蓝染成深蓝色，活细胞不被染色呈无色透明状。细胞活力测定须与细胞计数合并进行，但要考虑染液对细胞悬液的倍比稀释。三、细胞冻存复苏细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以节省人力、经费，减少污染和细胞生物学特性变化。

4、冻存复苏的原则：慢冻快融技术原理当细胞冷至0℃以下时，细胞器开始脱水，细胞中可溶性物质浓度升高并析出，在胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，胞内不致产生大的冰晶，否则会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是避免胞内重新形成冰晶。技术原理在细胞冻存时应加入低温保护剂。常用的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO）。DMSO是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低冰点，延缓冻结过程；并提高胞膜对水的通透性，使胞内水分在冻结前析出胞外，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。冻存方法预先配制冻存液：

5、70%培养基+20%血清+10%DMSO。胰酶消化对数生长期细胞，经离心弃上清后加入适量冻存液吹打成细胞悬液（1-5×106个/ml）。细胞悬液按规格加入至冻存管中，密封后标记细胞名称、研究者姓名和日期。4年内存活率最高可达80%以上。冻存方法标准程序冻存管臵于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，次日转移至液氮中长期保存。冻存管臵于程序降温仪中，先设定按1-2℃/min降温，达到-25℃以下时再按5-10℃/min降温，达到-100℃时可迅速转移至液氮中。冻存方法简易程序冻存管首先臵于4℃，约40min。之后臵于

6、-20℃，约30-60min。再臵于-80℃中放臵过夜。最后臵于液氮罐中长期保存。冻存方法快冻程序冻存管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳。通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按1-2℃/min速度降温，在30-40min内降至液氮表面，停30min后直接投入液氮中。复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴并不断摇晃，使管中的液体快速融化。在5min内将细胞悬液转移至培养瓶内，补充适量的预热的新鲜培养液。四、克隆形成实验平板克隆形成适用于检测单个贴壁生长细胞形成克隆的能力，从而反应细胞增殖状况。

7、对于肿瘤细胞来说，克隆形成能力越高则反应其恶性程度越高。两个指标反应细胞增殖能力：①克隆形成率；②克隆大小。平板克隆形成每平皿（D=60mm）接种100-200个细胞，补加培养液至10ml，≥3平皿/组。十字形晃动使细胞分散均匀，常规培养2-3周（当出现肉眼可见的克隆时终止培养），弃培养液，PBS洗涤2次。甲醇固定15min，姬姆萨染色20min，自来水冲洗，空气干燥。计数肉眼可见的克隆数。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。平板克隆形成平板克隆形成必须选择对数生长期细胞。计数要准确，至少三遍，取平

8、均值。在接种细胞时，细胞数避免过多，否则会出现细胞克隆融合并给计数带来麻烦，同时一定要使细胞分散均匀。一般情况下，接种200个细胞时，10ml培养液足够支撑3周，中间不必换液，主要注意防止污染。软琼脂克隆形成原适用于非贴壁生长细胞，但某些恶性肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其