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1、江苏食品与发酵1996年第1期柠檬酸的紫外分光光度测定法,.,l原理水中用约13ml的NaoH(smul/l)调pH78加CL)lg,柠檬酸(柠檬酸盐)在柠檬酸裂解酶(的人10m的抓化锌溶液(8om/100因)最后用重。.催化作用下被分解为草酸乙酸和乙酸(1)蒸馏水定容至100znl该缓冲液在+4℃下4周,.(l)柠檬酸些~草酞乙酸+乙酸内稳定使用前调至20e25℃..ol1):在苹果酸脱氢酶(MDH)和L一乳酸脱氢酶222NADH溶液(6m/CO:DH),将3OmgNADH一N为和60m少aH溶(L一L存在的情况下草酞乙酸和其脱经产。于6ml
2、重蒸馏水中该溶液在+4℃下4周内稳物丙酮酸被还原态的烟酸胺腺嗦吟二核昔酸定。(NADH)分别还原成L一苹果酸和L一乳酸(2)2.2.3MDH/L一LDH溶液(lmgMDH/(。3);:(2)草酞乙酸十NADH+H+些塑~L一ml4mgL一LDH/ml)0.lmOH(g0.4m几一LDHNAD+将以sm/叫)和苹果酸+。。g(3)丙酮酸十NA+H十L二二旦丝一,L一(sm/mD混合在+4℃下1年内稳定DH2.2.4CL溶液(lg蛋l=om白质加乳酸+NAD十32g冻干物加l=80U/ml):(ha在反应式(2)(3)中被氧化的NADH量与被将16
3、Omg冻干物(=smg酶蛋白)溶于0.,测柠檬酸的量可按化学反应式计算NADH的。5ml冰冻重蒸馏水中该溶液在+4℃下1周内、测定可根据其在波长334340或365nm处的吸,.稳定一20℃下4周内稳定。光度来计算2.2.5标准溶液0.40飞柠l):(橄酸/2试剂和计算..】将招4mg一水柠檬酸溶于10伪重燕馏2.1试剂水中。使用前配制。,a,c,甘氨酸甘氨酸NOH面lZNADH一2.3步骤aZ,Na3,,L一LDH,,NHC0MDHCL一水柠:,Hg365nn;波长340nmm或Hg334m玻瑞。檬酸等:;;:比色皿Icm光程温度20一25℃
4、最终体积..22溶液制备(用于约50次测定);:,302ml样品溶液4一8加g柠檬酸/比色皿(在...221054mol/l;..缓冲液(甘氨酞甘氨酸02一]9ml样品体积中);对空气(在光程上无..;Z+o:pH78Zn06mml/l)比色皿.)或水读教将7.139甘氨酞甘氨酸溶于约70l重蒸馏m吸人比色皿空白样品测定中浓度...100,缓冲液(l)ml100ml甘氨酞甘氨酸01smul/l...NADH(2)010ml010ml0Zmmol/l.。135样品或标准液190ml020ml直至约卜mul/-..70ml4义10,UM王,重蒸馏水
5、0Olml1DI八DHLDH(3)0..3XI护UM/01ml7LDH/l,:.混匀反应停止后(3一smin)读取溶液吸光度(A)开始加人cL反应·.CL(4)0olml0.olml2.6X10勺/1,,Z混匀反应完成后(约5一1omin)读取溶液吸光度(A)一31一江苏食品与发酵1996年第1期.,,确定空白和样品吸光度差值(Al一A:)再如果吸光度差值(△A)小于010样品溶液必:须重新制备(称取更多的样品或减小稀释倍数)将样品吸光度差值减去空白吸光度差值.△A~△A样昌一△A空白或吸人比色皿中的样品体积可增加到最大1,A,Z空白,g此时补
6、加的水量应使比色皿中样品和对照有时(一A)为负值此时只要根据公ml。,式加到(A,一AZ)禅品上为了使结果获得足够的的总体积保持不变在计算时应考虑样品体积v。.。,吸光度差值必须在10以上的变化准确度0.2.4计算31样品制备.:3.11液体食品根据计算浓度的一般方程式,VXM勺V过滤混浊的溶液再用约l%的聚酞胺或聚x△A[s/l]￡vXdXX1000乙烯聚毗咯烷酮(PvPP),如需要应稀释一脱色此处v二最终体积(ml);v~样品体积定的倍数。(ml);Mw一被测物质的分子量(g/mol);d=光,如果还需要测定醋化除了游离的柠檬酸外;￡:程(
7、rm)~NADH吸光度系数,,的柠徽酸例如多酚或花青素的柠檬酸醋醋必.一’一,340nm一63(1XmmolXcm),须首先用碱水解成游离的柠檬酸具体操作见.Hs365o,e一,恤=34(1Xmm一Xm)“’.酒一节的陈述.一Hg334ol‘e一‘nm=618(1XmmXm)3.1.!.1水、、果汁清凉饮料茶和其它饮料:以无水柠檬酸计,。.中柠檬酸的测定过滤去除浑浊物稀释样品使302义1921又△A一义△A.。.002一0.鲍/ml￡柠檬酸含量在即使溶液带有一又IX02X1000罕,。(g柠檬酸/l样品溶液)定的颇色其稀释后可直接用于测定只有当
8、溶,:液颜色很深且因柠檬酸含量低溶液不能稀释时以一水柠棣酸计..,:302又2101义△A一又△A才需要脱色操作步骤如下.。X1X0ZX10001.毕
