61临床生化分析方法

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1、临床生化分析方法一、分析方法分类(%1)终点法被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法(endessay)。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如TrinderR应测定尿酸，反应曲线上3〜5mi

2、n时其吸光度已趋向稳定，因而可将5iiiin作为反应终点。②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的浪甲酚绿法测定中，白蛋白与浪甲酚绿在10s内很快完成反应，Z后a球蛋白和B球贵白与浪甲酚绿发生〃慢反应〃，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达lOmin,因此终点时间应采用10〜30s,而不应选择lOmino1.一点终点法在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法(onepointendessay),其反应曲线见图7-3。其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU二(待测吸光度AU—试剂空白吸光度

3、AB)XKoK为校准系数，详见第五节二操作方法。2.两点终点法在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法(twopointendessay),其反应曲线见图7-4。计算公式为CU二(待测吸光度A2—待测吸光度Al)XKo该法能有效地消除溶血(hemolysis)黄疸(icterus)和脂浊(lipo-turbid)等样品本身光吸收(见图7-5)造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析屮第二试剂加入Z初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第

4、二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析屮，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校止。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。（二）固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光

5、度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-timeessay）,反应曲线见图7-6o其计算公式与两点终点法相同，为CU=（A2-Al）XKo有时也称此法为两点法。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如：苦味酸法测定肌酊，反应的最初30s内，血清屮快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌肝反应，且此段时间一吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酊）；在80〜120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，

6、使肌肝浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。（三）连续监测法连续监测法（continuousmonitoringessay）又称速率法（rateessay）,是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线屮线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（AA/min）计算结果，见图7-7A和所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图屮§1及§5值偏小，而62=63=64,故A1点至A4点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应，期间的AA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计

7、算AA/min,根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）=AA/minX理论（或校准）K值，代谢物浓度CU二AA/minX校准K值。关于理论K值和校准K值叙述如下：1.理论K值多用于酶活性测定屮，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性（U/L）二AA/minX,