小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法

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1、ICS 65.020.01B16     DB37山东省地方标准DB37/T3630—2019     小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法MoleculardetectionmethodsofTilletiafoetida&Tilletiacaries2019-07-23发布2019-08-23实施山东省市场监督管理局   发布目  次前言II1范围12术语和定义13仪器设备14主要试剂15分子检测15.1小麦种子中小麦普通腥黑穗病菌冬孢子基因组DNA提取15.2菌瘿中冬孢子基因组DNA提取25.3引

2、物序列25.4PCR扩增25.5电泳检测25.6检测结果判断36结果判定37样品保存38档案保存3前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省植物保护总站、山东农业大学。本标准主要起草人：于金凤、刘存辉、商明清、孙晓凤、杨勤民、金扬秀、李洪刚、张德满、张莉、谢传峰、徐鲁、成文华。小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法1　范围本标准规定了小麦普通腥黑穗病菌的分子检测方法。本标准适用于小麦普通腥

3、黑穗病菌的分子检测。2　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1　小麦普通腥黑穗病菌　Tilletiafoetida&Tilletiacaries指引起小麦普通腥黑穗病的病原菌统称，包括小麦光腥黑穗病菌（Tilletiafoetida）和小麦网腥黑穗病菌（Tilletiacaries）两种。2.2　小麦普通腥黑穗病菌分子检测　MoleculardetectionofTilletiafoetida&Tilletiacaries指依据小麦光腥黑穗病菌（Tilletiafoetida）和网腥黑穗病菌

4、（Tilletiacaries）的ITS序列，设计特异性引物，经PCR扩增获得特异性片段，依据特异性片段的有无进行判断检测。3　仪器设备摇床、显微镜、普通离心机、电热恒温水浴锅、移液器、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、锥形瓶、离心管、盖玻片、载玻片、电子天平等。4　主要试剂除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。CTAB缓冲液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、TE缓冲液、PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNAmarker、1×TAE缓冲液、琼脂糖、DNALoa

5、ding缓冲液、溴化乙锭、3mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液等。5　分子检测5.1　小麦种子中小麦普通腥黑穗病菌冬孢子基因组DNA提取5.1.1　称取50g小麦种子放入250mL锥形瓶中，加入100mL无菌去离子水，试验重复3次。1.1.1　摇床200rpm振荡5min后，静置10min。收集洗涤悬浮液于100mL离心管，8000rpm离心10min，弃上清，留沉淀。1.1.2　加入1.5mL无菌水，充分混匀，转至2mL离心管中，10000rpm离心5min，弃上清。1.1.3　用1

6、mL无菌水冲洗100mL离心管2次，洗涤液一并转移至2mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清。1.1.4　加入1mL浓度为3mol/L的NaOH溶液，65℃恒温水浴30min。取出离心管，用1mol/LHCl溶液中和，10000rpm离心2min，吸出上清液，加无菌水冲洗沉淀4次，离心，吸出上清液。1.1.5　向离心管内加入700μL预热至65℃的CTAB缓冲液，65℃水浴1h，每隔15min颠倒混匀1次。1.1.6　待冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1

7、），充分混匀，抽提2次～3次。1.1.7　10000rpm离心10min，将上清液转移至新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），充分混匀，抽提2次～3次。1.1.8　10000rpm离心10min，吸取上清液至1.5mL离心管中，加入等体积预冷至-20℃的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置30min。1.1.9　12000rpm离心15min，弃上清液，留沉淀。1.1.10　加入1mL70%乙醇冲洗管底的沉淀，12000rpm离心5min，弃上清液，重复2次。1.1.11　12000

8、rpm离心30s，去除残余的乙醇。1.1.12　置于超净操作台内干燥约15min。1.1.13　加入30～50μLTE缓冲液溶解DNA。注：也可采用经验证等效的该DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取。1.2　菌瘿中冬孢子基因组DNA提取取小麦病穗中的菌瘿，用镊子压破，释放并收集里面的冬孢子，转至2mL离心管，采用CTAB法（详见5.1.5～5.1.14）提取冬孢子基因组DNA。1.3　引物序列所用引物序列如下：XHS-F：5’-CTTTATTGCCGTACTTCTCTTCG-