曼氏无针乌贼Hsp70克隆及序列分析【开题报告+文献综述+毕业设计】

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1、本科毕业论文系列开题报告水产养殖曼氏无针乌贼Hsp70克隆及序列分析一、选题的背景与意义热休克蛋白是生物体内与抗逆相关的一类十分重要的蛋白。除高温诱导外，许多损伤因素、应激刺激（如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤、自由基等）作用后，都可以导致细胞发生热休克反应（谷文萍,1999），诱导热休克蛋白的合成。在不同条件引起的热休克反应中，热休克蛋白发挥着多方面的作用（Martin,1999）。热休克蛋白超家族(Heatshockproteinsuperfamily)是一类进化上高度保守的蛋白。这个家族包括至少6个

2、亚家族：Hsp110家族，Hsp90家族，Hsp70家族，Hsp60家族，Hsp20家族（小热休克蛋白家族），泛素（Ubiquitin）等。热休克蛋白70（Hsp70）家族是热休克蛋白超家族的重要成员，分子量约为68KD~74KD。热休克蛋白70除了具有分子伴侣的功能以外，在消除重金属污染对机体造成的损伤（Urani,2001;Ward,2001），调节受体数量（Helen,2001），调理细胞凋亡（Chen,2001）等方面都具有重要的作用。近年的研究表明Hsp70还能促进抗原提呈，参与机体的免疫反应。在胚胎发育初期，Hsp70对

3、胚胎也有一定的保护作用。随着分子生物学技术和生物信息学技术的不断发展和完善，Hsp70基因不断从不同种类的生物中被克隆出来，从而为深入研究Hsp70基因的功能及其表达调控规律奠定了基础。通过对大量生物的热休克蛋白70氨基酸序列进行研究表明，热休克蛋白70家族成员无论在一级结构上，还是在高级结构上都是高度保守的。因此本课题拟通过曼氏无针乌贼Hsp70基因5’端的克隆研究，然后合并分析已知的核苷酸序列，进一步进行多序列比对和等电点进化分化。为曼氏无针乌贼Hsp70基因提供分子生物学方面的参考数据和理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主

4、要问题：研究的基本内容：1.以cDNA为模板，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶纯化，连接转化提取质粒鉴定后送去生物公司测序。2.测序的序列与已知序列合并，对该核苷酸序列进行分析。3.对已知的核苷酸序列进行多序列比对和糖基化位点分析。4.对已知的核苷酸序列进行进化分析，并构建进化树。拟解决的问题：克隆出曼氏无针乌贼Hsp705’端的基因，并对其进行分析，为曼氏无针乌贼Hsp70基因研究提供科学数据与理论依据。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1RNA提取Trizol法提取RNA：取肌肉组织，液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱中备用。采用T

5、rizol一步法提取RNA，在紫外分光光度计上测定纯度和浓度，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳/EB染色检测所提RNA的质量。具体步骤如下：（1）在1.5mlRNase-free离心管中加入1mlTrizol，同时将其中少许Trizol留在离心管盖内；取50mg左右动物组织置于离心管盖内，用烘烤过的手术剪将组织彻底剪碎；（2）冰上放置5min，以使核蛋白质裂解彻底；（3）每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀30s，冰上放置3min；（4）台式高速冷冻离心机上，12000rpm4 ℃离心15min（离心后，混合物分为淡红色的

6、酚仿相、中间相和无色的上层水相，RNA就存在于水相中，水相大约占60%）；（5）将上清液小心转移到RNase-free1.5ml离心管里，加入0.5ml的异丙醇，冰上放置10min；（6）台式高速冷冻离心机上，12000rpm4 ℃离心10min（离心后，管底看见胶状RNA沉淀）；（7）弃上清，用1ml75%酒精洗涤RNA沉淀，7500rpm4 ℃离心5min；（8）弃上清，室温下放置5~10min，使酒精挥发；（9）加20µlDEPC-H2O溶解，-80 ℃保存。2cDNA合成cDNA第一链的合成使用M-MLV逆转录酶，操作步骤如

7、下：（1）在Microtube中配制下列混合液：反应液成分体积(µl)CDⅢ2μlRNA0.5~1µlRNAFreedH2O至8μl（2）将Microtube置于PCR仪或水浴锅中，72 ℃变性2min，迅速冰浴退火2min；（3）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：反应液成分体积(µl)RRI（RNA酶抑制剂）1μl5×M-MLVBuffer4μl10MmdNTP2μlM-MLV（逆转录酶）2μlRNAFreedH2O1μlTotalVolume10μl将上述Microtube管置于PCR仪或水浴锅中，经42 ℃10

8、min，然后加入SMARTⅢ、SMARTⅢ2、SMARTⅢ3各1μl混合后取2μl，经42℃90min及75℃10min的反应后将其置于-20 ℃保存。3聚合酶链式反应(PCR)根据已获得的部分核心序列，应用PrimerPremier