显微技术实验

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1、第三部分实验内容实验一细菌芽孢、荚膜、鞭毛的染色及形态观察一、目的要求1、学习掌握细菌制片的操作技术和无菌操作技术。2、学习掌握细菌芽孢、鞭毛、荚膜的染色方法。二、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。1.鞭毛是细菌的运动“器官，细菌是否具有鞭毛，以及鞭

2、毛者生的位里和数目是细茵的一项重要形态特征。细菌的椒毛很纤细，其直径通常为0 . 01～0.02um ，所以，除了很少数能形成毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观寮细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍鞭毛染色法和改良的Uifson 氏染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。2.细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法

3、只能使菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。3.荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易染色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法染色（负染色法），使菌休和背景着色，而荚膜不

4、着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。三、实验器材1、菌种：苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、褐球固氮菌（Azotobacterchroococcum）斜面菌种。2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、载玻片、盖玻片、试管、细玻棒、水浴锅。3、牛肉膏蛋白胨培养基、鞭毛染色液、0.5％沙黄水溶液、绘图墨水、95％乙醇、石炭酸复红染液、5%孔雀绿溶液、0.5%番红色液、蒸馏水、双料瓶（香柏油和二甲苯）。四、方法步骤1.细菌鞭毛染色步骤：（l）菌

5、种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1－2 次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a取新配制的营养琼脂斜面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28 ～ 32 ℃ 培养10～14h ，取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料；b选取新制备的营养琼脂（含0.8～1 . 0 ％的琼脂）平板，用接种环将新鲜菌种．点种于平板中央，28～32 ℃ 培养18 ～30h ，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落中央的菌谷）作染色观察的菌种材料。（2）载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20 min ，取出用清水充分洗净，沥干水后置95

6、％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。（3）菌液的制备。取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1－2 环无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片,也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。挑菌时，尽可能不带培养基。（4）制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，便菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温｛或37 ℃ 温室）自然千燥。干后应尽快染色不宜放，时间过长。（5）染色涂片干燥后，滴加鞭毛染色A 液顶盖3~5 min ，用熏馏水充分洗去A 液．用B 液冲去残水后，再加B 液夜盖涂片染色约数秒至l min ，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，若加

7、B 液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗，自然干燥。（6）镜检干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛．菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。2.细菌芽孢染色步骤：A.改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（l）制备菌悬液：加1-2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液