原位杂交手册

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1、第1章共用程序引言：本章介绍了本实验最基本的实验程序，包括中期染色体制片；质粒的转化与DNA的提取；探针标记检测以及基因组总DNA的提取第1节原生质体染色体制片试剂：饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液（新鲜3：1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纤维+2%果胶酶）、INHCl、95%酒精实验步骤：浸种室温下浸种约一天（也可1-2h）发芽培养皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留间隔，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，25-30℃下发芽，每天水洗一两次，约2-3天可取根。NOTE：换水是很重要的，水不能过多，以不留流动水为好，水分过多易长芽而根长不

2、好。预处理方法1：根长至1.5-2cm长时切取1.5mm左右的根尖，饱和a-溴萘约25℃处理2-3小时，水稻一般不预处理。方法2：根长好后将种子置于4℃冰箱处理一个晚上，第二天在25℃下恢复2-3h，也可得到许多分裂相。NOTE：何进取根尖最好具随机性，与季节以及细胞分裂时期很有关系。（玉米8:00AM，水稻11:00-12:00AM）水洗反复几次前低渗ddH2O或0.075MKCl（0.6KCl溶于100mlddH2O）低渗30min（室温）。固定新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃过夜。NOTE：一定要用新鲜固定液；如果用于石蜡切片组化显色

3、，甲醇固定的材料会导致很高背景，应换用4%多聚甲醛。水洗反复几次，洗净。酶解2%纤维素酶+2%果胶酶混合（1∶1），28℃下处理3小时左右。NOTE：酶解是最至关重要的一步，首先是酶的质量，很多酶都可导致分裂相少，以SERVA公司的果胶酶为最好，根据材料不同，酶解时间会有所变化。洗载片载片一定要干净，以防材料脱落和保持清洁的背景。洗片步骤：1）INHCl中3min以上2）自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗3）95%酒精浸泡30min以上（每片单独放入）制片小心吸去酶液，水洗几次，吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，

4、滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至着火。NOTE：敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，迅速涂开，火焰干燥，干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状，若小雨点上像有一层不透明的薄层，说明酶解时间不够。镜检检后将符合要求的制片储存于-20℃下备用。NOTE：每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的分裂相方可用于杂交。REFERENCES第2节质粒的转化与扩增若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段，首先要对其进行转化，一般利用E.Coli作为载体，转化的关键在于如何制备感受态的E.Coli细胞，本实验利用CaCl2来制备感受态细胞，此

5、方法简便、快速。试剂：LB培养基，0.1MCacl2，70%甘油实验步骤：感受态E.Coli的制备从-20℃下取2-5µlE.Coli，涂在平板上，37℃培养16-20h。挑取单个菌落于20ml已预热至37℃的LB培养基(不含Amp)中，37℃，300rpm剧烈振摇约3h。培养物转移至4支预冷的5mlEppendorf管,冰上放10min，4000rpm离心3-5min，回收细胞（4℃）；倒出培养液，倒置lmin。以5ml预冷的0.1MCacl2重悬每份沉淀，冰浴30min。4000rpm离心5min（4℃）；倒出培养液，倒置lmin。每管加预冷的

6、0.1MCaCl20.25ml，重悬细胞，冰浴lh每管100µl分装,保存于-20℃下,长期保存转化效率会有所下降。质粒DNA的转化取-20℃保存的感受态细胞二支，冰上溶解10min，一支加质粒cDNA(<10µl，<30ng)，混匀，另一支作为对照，冰浴30min。42℃水浴放置90秒，保持1-2min。快速置于冰浴，保持1-2min。每管加200-300µl培养基，用水浴加热至37℃。37℃摇床温育45min。扩增（无菌操作）将温育后的转化细胞转移至含抗生素（100µg/mlLB）的LB平板上。当液体被培养其吸收后，倒置平板，37℃培养12-1

7、6h，时间不宜过长。菌落生成后，挑取单个菌落，37℃于LB液体培养基中培养24h左右。加70%甘油，-20℃保存。第3节质粒DNA的提取试剂：LB固体培养基，LB培养基，Sol.Ⅰ，Sol.Ⅱ（当配当用），Sol.Ⅲ，Sol.VI，异丙醇，70%酒精，RNaseA，100%EtOH，TE溶液实验步骤：活化含重组质粒细菌用划线法接种在LB固体培养基上，37℃培养箱培养过夜。扩增挑选单个菌落接种在含20µlAmp的20mlLB培养基中，摇床，250rpm，37℃培养16-18小时，至溶液混浊，但不能培养过久。离心两支5mlEppendorf分装一半，8

8、,000rpm（过高速度的离心会导致沉淀物难以悬浮Sol.Ⅰ）离心10-15min，去上清液，再倒入另一半，重新离心，去上