双向荧光原位杂交手册(2_dimension-fish_protocol)

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1、组织（细胞）间期核2-dimensionDNAFISH实验步骤Note：依照本protocol进行该实验两大关键因素：一是样品玻片的制备，包括细胞核释放的多少，点片的细胞密度，玻片背景的干净与否，溶液的新鲜程度，蛋白酶消化的时间等；二是BAC探针的制备纯化，包括BAC的纯度，探针的质量，不同探针的比例，与样品孵育的时间等；另外，温度，湿度，光照也要严格按要求进行。一、组织间期核制备过程1．组织放入平皿中，加含50ul双抗的PBS5ml泡10min。2．用PBS洗一下，剪碎。3．加胶原酶5ul和培养液5ml放入37度过夜。（该步骤只针对不易释放游离细胞的组织）——过夜消化则以

2、上操作均需在超净台进行，以防污染（细胞：PBS洗两遍，消化细胞，收集，PBS洗一遍，细胞数太少则不洗）。4.将组织碎块（细胞）在15ml离心管中加0.075MKCL10ml，37℃水浴锅内低渗30min。5.取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3滴混匀，室温1000rpm离心10min弃上清。6.加固定液10ml混匀后，室温静置30min，离心弃上清。7.步骤6重复三次后加入固定液1.5ml，混匀后静置1~2min，将上层较为清亮的细胞悬液约1ml转于1.5mlEP管内4℃存放。（长期可置-20℃冻存）8.点片：将适当细胞密度的悬液0.2-1µl点于玻片上，用钻石笔在玻

3、片背面划出范围，室温过夜。二、荧光探针的标记（随机引物）1.预变性(PCR仪)templateDNA(dsDNA)200ng2.5xKenelowbuffer(invitrogen)10µlddH2O---------------------------------------------------Σ12.5µl95℃10min2.取出PCR管,立即放冰上1~2min3.室温加缺T的dNTP(A/C/G:T=0.5:0.25),各管加4µl4.快速各加8µl所要标记的荧光素(eg.Cy3-dUTP)，马上避光5.再各加0.5µlKenelow酶，混匀后轻微离心一下（甩一下

4、即可），37℃避光过夜（16小时以上），此时PCR管内溶液的总体积为25µl。6.第二天加2.5µlstopbuffer混匀，瞬时离心后4℃避光存放。三、Fluorescenceinsituhybridization(直接标记)注意：73℃水浴锅应在实验前开始调温度开关键，立式染缸应在40℃前放入水浴锅，否则易使染缸破裂。（一）、前期处理玻片的处理1.10µg/µlRNase1.0µl现配1：100溶于2XSSC99µl,37℃消化40min(将2XSSC加到PCR管中再将RNase加到2XSSC中，混匀，用移液枪将混匀的液体吸起再加到载玻片的染色体上，再剪下PE手套，展开

5、成适当大小的薄膜覆盖在印迹上，避免液体蒸发，放37℃的湿盒中40min)。2.2XSSC3minX2(揭开薄膜将玻片放在2XSSC的染缸A中，3min后取出将玻片下沿挂的液珠放在几层的卫生纸上吸干，再放在2XSSC染缸B中3min)3.取出，再按照上述的方法吸干液珠，依次放入75%、85%、100%的乙醇2minX3次，晾干4.蛋白酶消化:吸取60µl1XPepsin(现配0.01NHCl:1%pepsin=200:1)加到玻片的印迹上，用PE做成的薄膜覆盖在上面，37℃温箱中放15~20min(在加pepsin前，先要混匀,消化时间应根据不同样品的通透性和探针的种类做预实

6、验而定)。5.1XPBS，5min6.固定(取出玻片，放入1%的多聚甲醛的立式染缸里，10min)7.1XPBS，5min8.脱水(三次75%、85%、100%乙醇脱水2minx3次)，晾干9.70%FA变性，73℃，2-3min10.取出，放入预冷的2XSSC，3minX211.然后，梯度乙醇脱水(75%、85%、100%)2minX3，晾干探针的处理标有荧光的探针V1=Va+VbCot-1(封闭中度重复序列)V2=(1-2倍V1)SSDNA(封闭高度重复序列)V5=1/10(V1+V2+V5+V6)5µlddH2OV6=50µl-(V1+V2+V5)ΣV1+V2+V5+

7、V650µlNaAc(3mol/l)(沉淀探针)V3=1/10(V1+V2+V5+V6)5µl100%乙醇(-20℃)V4=2X(V1+V2+V3+V5+V6)110µl1在PCR管内混匀(以上混合液放在纸盒内，不停的转动，以使混合液混匀)出现白色沉淀2-80℃，30min-12h注意：有时还需加鲑鱼精(SSDNA)：5µl(封闭高度重复序列，13、14、15、21、22号染色体有随体DNA即有高度重复序列)312000rpm，4℃，10min，去上清4加适量的-20℃预冷75%乙醇，12000rpm，4℃，5mi