HGH质量检定实验

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1、.产品质量研究对于rHGH产品的质量研究贯穿整个实验室研究、中试研究过程，并对工艺各阶段进行严格的质量控制，确保产品的高质量。对中试产品的质量控制分两方面进行：1.半成品/成品的质量控制；2.成品的质量控制。均严格按照《中国生物制品检定规程》（2000版）中各相关规定与程序进行。一．产品质量研究1．半成品质量检定1.1免疫印迹试验：用鼠抗人的HGH单克隆抗体（NEOMARKERS公司）对rHGH进行WesternBlot分析。结果见图1，rHGH显示强阳性。M　12312397kD66kD43kD31kD20kD14kD(A)(

2、B)图1.rHGH表达SDS-PAGE及Western-Blotting图（A）：SDS-PAGE胶　（B）：Westernblotting膜M:Marker；1.2.3HGH原液冻干品..1.2紫外光谱扫描：根据《中国生物制品检定规程》（2000版）中“紫外光谱测定”的具体方法进行。将纯化样品用生理盐水稀释到0.5mg/ml，加入1cm石英吸收池内，在220-300nm波长范围内扫描样品。图2－1批号rHGH扫描图图2－2:20020902批号rHGH半成品扫描图同时还扫描另外2个批号半成品，特征波长如下：样品特征峰波长nm吸

3、光值200209012790.42417200209022790.41222..200209032790.43200可见，本产品蛋白质特征峰在277±3nm范围内1.3纯度及分子量检测a.SDS-PAGE电泳：用非还原型SDS-PAGE法检测样品的纯度，还原型SDS-PAGE法检测样品的分子量，将待检样品加上样品缓冲液，加热5分钟，上样，使加样量不低于5μg（银染法）或10μg（考马氏亮蓝R-250染色法），经PharmaciaVDS扫描分析。abcab‘c‘ab‘’c’’图3－1.半成品还原、非还原SDS-PAGE电泳a.Ma

4、rkerb.2012011批号rHGH还原处理c.2012011批号rHGH非还原处理b’.2012012批号rHGH还原处理c’2012012批号rHGH非还原处理b’’2012017批号rHGH还原处理c’’2012017批号rHGH非还原处理扫描结果如下：样品名称主带扫描面积％分子量(Da)2012101198.5220152012101297.9222042012101799.522125..可见，半成品迁移位置一致，连续3批半成品扫描纯度达到95%以上，连续3批半成品分子量为22125±205.92，说明用非还原电泳检

5、测蛋白纯度和用还原电泳检测蛋白分子量方法可信。b.分子量检测：（质谱法）使用对照品（SaizenHGH），加250ml无菌PBS溶解成100mg/ml，10ul分装。将对照品与样品做质谱检测，分子量均为22125D。图3－2对照品质谱图图3－3批号20031027样品质谱图c.HPLC纯度分析：在方法建立之时，我们采用SaizenHGH对照品做对照，同时以原液缓冲体系做基线。具体方法如下：..色谱条件色谱主机厂家与型号：Waters600486色谱柱厂家与规格：WatersC183.9×300mm流动相：A:10％乙氰+0.1％

6、TFAB:乙氰＋0.1％TFA梯度：timeflowA%B%0110002512080301208033101003511000流速：1.0ml/min样品上样浓度：标示量为0.5mg/瓶，加纯化水溶解成1mg/ml样品上样量：20ul检测波长：280nm结果如图：样品纯度97％..HGH标准品HPLC图谱NameRetentionTimeArea%AreaHeightIntTypeAmountUnitsPeakTypePeakCodes122.0381254590100.0055204BBUnknownHGH原液冻干品HPLC

7、图谱NameRetentionTimeArea%AreaHeightIntTypeAmountUnitsPeakTypePeakCodes117.872171790.70453BBUnknown220.04969661.09275BBUnknown321.61769901.301382BVUnknownI06..422.07759170797.0025451VBUnknown同时研究其它2个批号半成品，其保留时间、主峰面积如下：样品名称保留时间主峰面积％标准品22.0381002003101722.07797.002002090

8、222.04597.122002090322.05698.20可见，对照品与样品的主峰时间大致相同，半成品纯度为97％-100％，本实验方法可以用于HGH纯度测定。1.4等电点测定：根据《中国生物制品检定规程》（2000版）中“等电点测定”的第二法“等电聚焦水平