ABI 3500xL基因分析仪操作流程

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1、ABI3500xL基因分析仪操作流程一、标准测序反应（一）质粒测序标准实验流程1．对质粒DNA的质量和浓度要求纯度：OD260/OD280=1.6~2.0，用量：每反应150~300ng。2．测序PCR反应标准反应体系：3．测序产物纯化：使用EdgeBio收集柱进行纯化。（1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。（4）取10µLHi-DiFormamide加入96孔板中，再加入10µL待测样品，振荡混匀离心。（二）PC

2、R产物测序标准实验流程1．对PCR产物的要求纯度：OD260/OD280=1.6~2.0，用量：每反应10~100ng。强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。2．PCR产物的测序PCR反应标准反应体系：3．测序产物纯化：方法同上。二、上机测序（一）启动系统1.打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。2.打开3500xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。3.启动电脑桌面Datacollectionsoftware。4.检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击。5.检查耗材状态：点击“Refresh”，更新后检查

3、仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。1.仪器预热：点击仪表盘上的“StartPre-heat”按钮预热炉子和泳道。（二）放置待测样品1.检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。2.将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。3.按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。（三）创建平板1.点击CreatePlateFromTemp

4、late，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入详细的平板信息，包括Name,NumberofWells,PlateType,CapillaryLength,Polymer。一般详细如下。1.点击屏幕下方的AssignPlateContents。（1）输入各个孔的样品名称等信息，Resultsgroup：输入结果的保存路径。（2）选中下面控制面板上Assay，Filenameconvention，Resultsgroup三个项目。（3）点击LinkPlateforRun→OK。2.检查屏幕上显示的各种

5、信息，确定正确无误后点击StartRun，即启动运行。（四）监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。1.可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看InstrumentRunViewsandFlags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。2.可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。3.启动、暂停或继续运行。（五）查看结果点击ReviewResults即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。一、分析测序结果1.打开软件：双击电脑桌面SequencingAnalysisv5.4图标。2.导入结果：点击

6、工具栏中Addsamples按钮，选择路径，导入待分析的测序结果。3.分析：Samplemanager中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用BC(baseclling,将原始结果翻译为对应的碱基序列)。（1）选中BC复选框，点击工具栏中Startanalysis按钮，即开始分析。（2）分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件。（3）点击工具栏中Analysisreport按钮，可查看结果状态(BCstatus)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。（1）选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果。A．sequence显

7、示碱基序列及其QV评分结果。注意：a.蓝色：HighQV=20+，结果可信；黄色MediumQV=15to19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色LowQV≤15，结果不可信。b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。B．Electropherogram显示电泳峰图及序列。C．Raw显示看到原始电泳图。1.打印：Samplemanager中选中P(print)复选框，点击Startanalysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。操作注意事项1.测序反应：（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用

8、；模板用量也有规定。（2）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释比较可靠。（3）反应