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1、1细胞培养的概念（第一讲）指从体内取出组织、细胞制成单个细胞悬液在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使其生存和生长，并维持其结构和功能特性，维持存活与増殖。培养过程中细胞不再形成组织。也可以用已建系的细胞株（系）复苏后继续培养，多是癌细胞。目的：进行后续的生命科学研究和细胞操作。2利用细胞培养技术进行生命科学研究的优点（第一讲）（1）研究的对象是活的细胞。（2）研究的条件可以人为控制。（3）研究的样本，可以达到比较均-性。（4）研究的内容便于观察、检测和记录。（5）研究的范围比较广泛。（6）研究的费川相对比较经济。3试
2、述影响体外培养细胞生长的各种因素（第一讲）（1）无毒无污染细胞培养环境（2）恒定的生长温度（3）介适的气体环境°（4）PII缓冲系统（5）理想的渗透压（6）湿度和光（7）影响细胞生长的其他因素（放射线、机械振动、接种密度等）4接触抑制，密度抑制（第四讲）（1）接触抑制：培养的细胞在培养环境中相互接触后，如是正常细胞，和互接触能抑制细胞的运动。肿瘤细胞无此功能。（2）密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制后，只要营养充分，细胞仍能增殖分裂，细胞密度进-步增大，营养成分减少，代谢产物（毒性物质）増多，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。5贴壁细
3、胞贴附和铺展的意义（第四讲）（1）贴附的意义：①贴附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基木要求，细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附，是细胞培养以后能否成功的第一步。②细胞悬附后，耽搁的越久，越容易发牛退化，提供什么样的生长表而是细胞能否成功粘附的主耍因素。（2）铺展的意义：①铺展状况是调节细胞形状的主要方面：铺展的越好，细胞越扁，细胞与生长基质表面接触面越大。②铺展状况与细胞的生长有密切关系：铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行。通过比较贴壁依赖性细胞不同铺展程度与DNA1＞成率Z间的关系
4、，发现细胞越扁（厚度越小）DNA合成率越高。6肿瘤细胞的取材、分离和培养过程（第三讲）（1）取材与分离：一半来自外科手术或活检瘤组织1实体瘤：取原发肿瘤组织或转移灶，去除溃疡、坏死组织，双抗雄素浸泡，洗液洗净，消化分散，尽快培养；2体腔液：无菌条件下取胸、腹水，不需抗凝剂，可直接以1200r/min收集细胞,不要久置和冷却。3血液或骨髓：通常取口口血病患者，5^10ml,肝素抗凝，置丁-试管立即分离培养，取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4°C中，但不宜超过24h（2）培养过程：1组织块法:l-2mni3小块接利吁涂冇鼠尾胶原
5、的培养瓶中，37°C恒温，5%C02；2酶消化法:0.25%胰蛋白酶消化，洗涤，吹打成细胞悬液，然后调整浓度至（5-10）X108/L,置于37°C,5%C02,完全培养基；3脱落细胞法:将组织切成细薄片，上皮类细胞随切割脱落，然后洗涤细胞，获较纯上皮类细胞，置于37°C,5%C02,完全培养棊，2-3天换液,7-10天汇合单层。7干细胞的取材、分离和培养过程（第三讲）干细胞是一类具有口我更新和分化潜能的细胞，在一定条件下分化成具有特定形态和功能的成熟细胞。分类：干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两人类，成体干细胞冇可分为造血干细胞、间充质干细
6、胞、神经干细胞、表皮干细胞等。1、胚胎干细胞分离：超排卵形式培养过程：1、将桑趺胚和胚胞接种丁•辅有饲养层MEF细胞的培养皿中培养2-—3天；2、吸出1CM细胞团；3、用0.25%胰蛋口酶和0.2mmol/LEDTA混合消化液消化5分钟；4、解离细胞团移至有MEF饲养层的24孔培养板培养4d；5、胰蛋口酶消化ICM细胞团继续培养；6、克隆纯化ES细胞巢密度逐渐转移到较大容积的培养瓶。2、成体干细胞
7、：分离方法：1全骨髓法：根据干细胞贴壁特点，定期换液除去不贴壁细胞；2密度梯度离心法：根据骨髓细胞屮细胞成分比重不同进行分离，常川丁-造血干细胞和
8、间充质干细胞；3免疫方法：流式细胞仪流式、免疫磁珠分离法，成本高,技术难度大等，使用较受限。培养方法：（需分开说）造血于细胞:先取材,后通过全骨髓法或密度梯度离心法分离纯化细胞,再接种到培养基中,最好用无血淸培养基或限定培养基，可使HSC维持未分化状态超过9代。间充质干细胞:先获取骨髓抽提物，后通过全骨髓法或密度梯度离心法分离纯化细胞，接种到培养基，Z后用流式细胞仪分析表面抗原，表达SH2、SH3、CD29、CD44等，不表达CD14、CD34、CD41、CD45等，以此来鉴定纯度。神经「•细胞和农皮丁细胞的培养过程基本同HSC、MSC.8叙
9、述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞传代方法（第二讲）（1）
10、悬浮生长细胞的传代
11、：1氏接传代法:悬浮细胞自然沉淀瓶底，轻轻吹打成细胞悬液，用吸管吸去上»1/2—1/3
