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《胚胎肝干细胞癌变潜能的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、胚胎肝干细胞癌变潜能的研究【摘要】「【的研究肝干细胞癌变的可能性。方法取孕14d的小鼠胚胎肝细胞作为肝干细胞移植到雌性小鼠肝脏，二乙基亚硝胺诱导肝癌。6个刀后取肝癌结节做连续切片，免疫组化或免疫荧光分析Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)、AFP、胎盘型谷胱甘肽转移酶(GST-P)或角蛋1‘119的表达，以研究肝癌的细胞來源和特征。结果6个月后诱导多发性肝癌结节。实验组17.1%的川•细胞癌结节SRY染色阳性，胆管细胞癌结节SRY染色均为阴性。肝细胞癌结节表达AFP和GST-P,而不表达角蛋白19o胆管细胞癌结节不表达AFP和G
2、ST-P,而表达角蛋白190结论移植的川:干细胞转变为肝癌，并口保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征,仍表达GST-P和AFPo提示在诱导肝癌过程中移植的肝干细胞有直接癌变形成肝细胞癌潜能。【关键词】川:癌胚胎肝脏肝干细胞癌变迄今为止，还不清楚肝癌起源于何种细胞［1,2］。有两类细胞可能是肝癌的细胞起源：一种是肝干细胞(或肝祖细胞)，另一种是成熟肝细胞。肝干细胞存在于成体肝脏Hering管附近的卵恻细胞和胚胎肝脏内的肝祖细胞［3,4］。越来越多的研究提示肝癌由肝干细胞恶性转化而来，是干细胞成熟受阻的结杲［5］。然而，干细胞与肝癌的直
3、接关系未见文献报道。本研究应用胚胎肝细胞作为肝干细胞移植给雌性小鼠，持续诱导肝癌，探讨肝干细胞癌变的潜能。1材料与方法1.1材料①实验动物：6卫周龄的BALB/c小鼠，体重20〜25g,购于中山人学医学动物中心。②主耍试剂：二乙基亚硝胺(DEN,Sigma-Aldrich)o抗体包插兔抗甲胎蛋H(AFP)多克隆抗体(SantaCruz,CA),兔抗白蛋白多克隆抗体(Dako,Denmark),羊抗细胞角蛋白19(cK19)单克隆抗体(SantaCruz,CA),兔抗胎盘型谷胱昔肽转移酶(GST-P)多克隆抗体(Stressge
4、n,Canada),羊抗Y染色体性别决定区域蛋口⑴只丫)多克隆抗体(SantaCruz,CA)。1.2胚胎肝祖细胞的分离和移植雌雄小鼠同笼24h后分开，记为0d,取孕14d的胚胎川:脏,胶原酶消化法分离胚胎肝细胞。分离的胚胎肝细胞作为肝干细胞，被认为rh50%的雄性细胞和50%的雌性细胞组成。雌性小鼠麻醉后行2/3川沏除，分离的胚胎肝细胞经肠系膜静脉注射到肝脏，每只小鼠移植l×106个细胞。1.3动物分组及二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌70只雌性小鼠随机分为3组:A,正常对照组(n=10),肝干细胞移植及饮正常水；
5、B,动物模型组(n=30),饮水屮加DEN诱导肝癌；C,实验组(n=30),肝干细胞移植及饮含DEN的水。术后小鼠恢复1周，DEN加入饮用水中，浓度为100μo/L,连续饮用12周诱导癌变［1］。诱癌第4、5月各取2只小鼠肝脏标本检查肿瘤形成情况。其余小鼠在诱癌后第6个月麻醉后取肝脏石蜡包埋。取肝癌结节做厚5um的连续切片。1.4肝脏病理学检查取孕14d、18d的胚胎肝脏及出生Id、7d的新生鼠肝脏做HE染色。孕14d的胚胎肝脏用免疫组化分析AFP、白蛋白、CK19、GST-P的表达。取实验组35个肝细胞癌结节和5个胆管
6、细胞癌结节标本的连续切片，分别做HE染色及免疫组化或免疫荧光(SRY、AFP、GST-P.CK19)。用SRY的表达确定小鼠肝肿瘤来源于移植肝干细胞［6］。用AFP、GST-P.CK19的表达来鉴定肿瘤细胞的特征。1.5统计学分析计量资料以均数土标准差(x土s)表示，多组间比较采用One-WayANOVA分析。采用SPSS10.0统计软件包分析，Pv().O5为有统计学差异。2结果2.1胚胎肝祖细胞的特征孕14d的胚胎肝脏见散在分布的肝细胞，细胞核大，胞浆少，核质比例大，细胞形态不均一。孕18d的胚胎肝脏内的肝细胞增多，细胞核
7、仍较人，胞浆少。出生Id、7d的新生鼠的肝细胞体积人，胞浆丰富，核质比例减小，细胞形态趋于均一。结果显示孕14d的胚胎肝细胞呈现肝干细胞的特征，数量少。随着孕期延长，胚胎肝干细胞逐渐成熟及肝细胞数量增加。孕14d的胚胎肝脏内肝祖细胞表达AFP、口蛋白、CK19、GST-P,阳性染色分布于细胞质(图1,A-D),X表达反映了胚胎肝脏的干细胞特征。这类细胞约山肝脏内细胞的20%o图1孕14d小鼠胚胎肝脏的特征(IHC,×200)(略)(A)表达AFP；(B)表达白蛋白；(C)表达角蛋H19；(D)表达GST-Po2.2
8、诱癌小鼠的成活率和成瘤率6个月后,诱癌模型组有8只存活,成活率为30.8%；诱癌实验组有9只成活，存活率为36.9%,两组间的存活率无显著差异(P>0.05)o诱癌成活的17只小鼠有15只检出肝癌，诱癌率为88.2%o两组间的诱癌率无显著性差异(P>0.05)o肿瘤在肝脏形成
