狗牙根黑穗病病原菌的鉴定及其培养特性

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1、狗牙根黑穗病病原菌的鉴定及其培养特性摘要：狗牙根(Cynodondactylon)是耕地、果园及其他草种草坪常见的恶性杂草，为探索其生物防治方法，试验从患黑穗病狗才根穗部分离到一株真菌LHL1,对其进行分子鉴定及生物学特性研究。液体发酵培养确定其最佳碳源和氮源及最适pll;苯胺蓝染色、光学显微镜镜检法观察感病狗牙根各部位菌丝和砲子分布情况。结果表明，菌株LHL1为担子菌亚门(Basidiomycotina)黑粉菌目(Ustilaginales)黑粉菌属(Ustilago)；该菌的最佳碳源和氮源分别为廿油和水解乳蛋白，最佳pH为5；镜检结果显示在感病植株的叶鞘内

2、表皮有大量菌丝及抱子分布，茎、叶及分篥芽鞘表面均有砲子存在。关键词：狗牙根(Cynodondactylon)；菌株LHL1；生物防治中图分类号：S543+9；S435.121.5文献标识码：A文章编号：0439-8114(2014)03-0575-05狗牙根(Cynodondactylon)又名百慕达，为禾本科多年生草本植物,匍匐茎发达，蔓延力强［1,2］,根状茎具有解热利尿、舒筋活血的作用，叶提取物具降低血糖、抗氧化的作用［3］。狗牙根目前作为草坪草种广受欢迎，但因其侵占性和再生性强，是耕地、果园及其他草坪草种的危害性杂草。黑穗病是一种由幼苗期进行系统性侵染

3、从而引发全株发病的病害，苗期侵染花期发病，花期穗上具充满砲子堆的病瘻［4］,感病花不能正常开花结子。狗牙根黑穗病的高发期在每年的7~9月，主要依靠砲子传播。狗才根黑穗病致病菌通过来自种皮或土壤的越冬抱子产生菌丝侵染发芽种子的胚芽鞘，并扩散至整个植物组织；狗牙根黑穗病致病菌对狗牙根的种子萌发、出苗无影响，但对匍匐枝的生长、干物质总量的积累、竞争力都有明显的降低作用［5］。在中国有关狗牙根黑穗病致病菌的研究鲜有报道；在其他国家，早在20世纪70年代对狗牙根黑穗病致病菌有相关报道,但主要集中在不同碳源及抗生素对菌落形态的影响，以及氯霉素对狗牙根黑穗病致病菌呼吸链电子

4、传递的影响等［6,7］。狗牙根黑穗病致病菌可严重影响狗牙根草坪生长成坪，但对防除田园狗牙根杂草具有积极作用。本研究从潔河医学高等专科学校草坪患黑穗病狗牙根花穗上分离到一株真菌，对其进行了微生物学及分子生物学鉴定，以期为将狗牙根黑穗病致病菌开发成狗牙根生防菌提供依据。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1菌株菌株LHL1由实验室人员从潔河医学高等专科学校草坪感病狗牙根穗分离得到。1.1.2培养基、试剂和仪器营养琼脂斜面培养基，马铃薯蔗糖固体培养基（每升成分：马铃薯20g,蔗糖20g,琼脂18g）,马铃薯蔗糖液体培养基（每升成分：马铃薯20g,蔗糖20g）,基础培

5、养基（用200g马铃薯煮水后滤液定容至1000mL）,1%酵母膏培养基；试剂均为分析纯；Pfu高保真酶、底物以及总DNA提取试剂盒均采用北京全式金生物技术公司产品。OLYMPUSBx51型光学显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司］。LGJ-18S型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌株分离纯化及保存菌株分离：在超净台上将感病植株穗部轻轻接触马铃薯蔗糖固体培养基，使抱子脱落至培养基，28°C光照培养至长出菌落，再挑单菌落接种于另一个马铃薯蔗糖固体培养基，进行菌株分离纯化。获得菌株LIIL1于营养琼脂斜面培养基4°C保存。1.2.2培

6、养方法活化培养：将保存于4°C营养琼脂斜面培养基的菌株LHL1接种丁直径9cm的马铃薯蔗糖固体培养基上，28°C培养。种子液培养：无菌条件下，用接种针从培养好的平皿中挑取单菌落接种于装有100mL马铃薯蔗糖液体培养基的250mL三角瓶中，在28°C,200r/min振荡培养3d。摇瓶发酵培养：无菌条件下，按0.6%接种量吸取种子液转接于含100mL马铃薯蔗糖液体培养基的250mL三角瓶中，在28°C,200r/min振荡培养。1.2.3不同培养基対LHL1菌落形态的影响将菌株LHL1分别接种到8个1%酵母膏培养基上，并在其屮7个培养基屮分别添加3%蔗糖、4%葡

7、萄糖、0.5%葡萄糖、3%果糖、3%麦芽糖、3%廿油、3%乳酸钙，28°C培养5d观察菌落形态。1.2.4处理设置在基础培养基中分别添加浓度为20g/L的不同碳源：甘露糖、葡萄糖、果糖、甘油、麦芽糖、乳酸钙、蔗糖，28°C、200f/min摇床培养7d,以确定最佳碳源；20g/L廿油+基础培养基中分别添加浓度为2g/L的不同氮源：氯化鞍、硝酸钾、尿素、甘氨酸、水解乳蛋白、酵母膏，以20g/L甘油+基础培养基为对照(CK)；在马铃薯蔗糖液体培养基中用2mol/LHC1和2mol/LNqOH调pH至4、5、6、7、8、9、10o所有处理设3个重复。1.2.5LHL

8、1菌株ITS鉴定ITS鉴定釆用试剂盒提