无菌检验验证方法指导

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1、1目的起草人审核人批准人起草日期年月曰审核日期年月曰批准日期年月曰起草部门质量管理部生效口期年月日分发部门：办公室、生产管理部、质量管理部指导检验方法的验证，确保检验方法验证顺利、有效的进行。2适用范围适用于高效液相、气相色谱的系统适用性试验、无菌试验、微生物限度试验及化学分析方法的验证。3职责3.1质量管理部经理负责检验方法验证的组织实就。3.2检验方法验证小组成员负责具体的验证工作。4内容4.1检验方法验证必备的先决条件4.1.1分析仪器应经过校正、确认或验证，并在有效期内；4.1.2验证人

2、员应经过培训，熟悉方法及所使用的仪器。4.1.3应有购口法定机构法定参照品、可靠供应商的参照品或口备参照品。口备参照品其纯度和性能可口行检测或法定检验机构检测。4.1.4所用材料，包括试剂、实验用容器等，均应符合试验要求，不给实验带來污染、误差。4.1.5应在开始进行方法验证询考察试验溶液和试剂的稳定性，确保在检验周期内试验溶液和试剂是稳定的。使用自动进样器前，一般是预先配制好-系列样品溶液置进样器中，依次进样，这时应确保进样周期内样品溶液是稳定的。4.2高效液相、气相色谱的系统适用性试验4.2

3、.1在使用高效液相色谱和气相色谱进行检测前必须进行系统适应性试验的验证，既用规定的对照品对色谱系统进行试验，分离度、理论板数、重复性、拖尾因子等指标应符合要求。1)理论板数(n)：在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图，量岀供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR和半高峰宽Wh/2,按n二5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。1)分离度(R)：在定量分析小，要求待测峰为其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰Z间有较好的分离度，一般要求应大于1・5,计算

4、公式为：R=2(tR2-tRi)/(Wi+W2)t&为相邻两峰中后一峰的保留时间,th为相邻两峰中前一峰的保留时间，叭及W2为此相邻两峰的峰宽。2)重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，其峰而积测量值的相对标准偏差应不人于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别一至少进样2次，计算平均校止因子，其相对标准偏差应不大于2.0%。3)拖尾因子(T)：为保证分离效杲和测量精度，应检查待测峰的拖尾

5、因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：T=W0.o5h/2diWo.o5h为5%峰高处的峰宽；d,为峰顶点与峰询沿之间的距离。4.2.2如分离度、理论板数、重复性、拖尾因子等指标不符合要求，可对色谱分离条件作适当调整，直到满足要求。4.2.3如检测设备更换或检测方法改变必须重新进行系统适用性试验。4.3无菌检查方法的验证4.3.1菌种使川的菌种有6种，分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽砲杆菌、生砲梭菌、口色念珠菌和黑曲霉。菌种的传代次数不得超过5代。4.3.2菌液制备接种金黄

6、色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽葩杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种牛砲梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35°C培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基屮，23〜28°C培养24〜48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数小于lOOcfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜而培养基上，23〜28°C培养5〜7天,加入3〜5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将饱子洗脱，然后吸出泡子悬液至无菌试管内，

7、用0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含砲子数小于lOOcfu的抱子悬液。4.3.3薄膜过滤法将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，过滤，冲洗完毕，将硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基加入滤筒内，再加入试验菌液。另取一装有同体积培养物的容器，加入等量试验菌液，作为对照。细菌组30—35°C,1—3天观察生长情况；真菌组23-28°C,3〜5犬观察生长情况。各试验菌同法操作。同时将等量菌液注入平皿计数。4.3.4直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于lO

8、Ocfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽他杆菌、牛抱梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于lOOcfu的口色念珠菌和黑曲霉各2管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为对照；细菌组30〜35°C,1〜3天观察生长情况；真菌组23〜28°C,3〜5天观察生长情况。同时将等量菌液注入平」IIL计数。4.3.5结果判断与菌-液对照管比较，含供试品各容器中的试验菌生长良好，试验方法成立；含供试品任一容器中的微主物生长微弱、缓慢或不生长，试验方法不成立。当方法不成