环境微生物学综合性实验指导书

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1、环境微生物学综合性实验指导书适用专业：环境科学指导老师：陶雪琴，郭堺仲恺农业工程学院环境科学与工程学院二零零九年九月多管发酵法测定水中的大肠菌群数和粪大肠菌群数一、实验目的和要求1、拿握多筲发酵法测定水中总大肠菌群的技术。2、掌握多管发酵法测定水中粪大肠菌群的技术。二、原理总大肠菌群和粪大肠菌群町川多筲发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据人肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽沦，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（mostprobablen

2、umber），简称MPN表示。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的人肠杆菌密度和卫牛质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有人于实际数字的倾向。不过只要每一稀禅度试管重复数「I增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求觅复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。粪人肠菌群是总人肠菌群中的一部分，主要來自粪便。在44.5°C温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的人肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，

3、造成不利于来向自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出來的菌主要为來自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。三、仪器与培养基和试剂1、高压熬气灭菌器。2、恒温培养箱、冰箱。3、牛物显微镜、载玻片。4、酒粘灯、银珞丝接种棒。5、培养皿（直径100mm）、试管（5X150mm）,徳汉小倒管、吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、lOOOmL）、采样瓶。培养基及染色剂的制备：1、乳糖蛋白腺培养液：将］0g蛋白腺、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解TlOOO

4、mL蒸馅水中，调节溶液pH为7.2—7.4,再加入1.6%溟甲酚紫乙醇溶液lmL,充分混匀，分装于试管中，于12I°C高压灭菌器中灭菌15min,贮存于冷暗处备用。2、三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋口腺培养液的制备方法配制。除蒸钢水外，各组分用量增加至三倍。3、EC培养液：将20g胰腺、5g乳糖、1.5gflJI盐三号、4g磷酸氢二钾（K2HPO4）、1.5g磷酸二氢钾（KH2PO4）、5g氯化钠、加热溶解于1OOOmL蒸馆水，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压熬汽火菌器屮，115°C灭菌20mino灭

5、菌后pH应为6.9。4、伊红美蓝培养基（1）贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—3Og琼脂加到900mL蒸饰水中，加热溶解。再加入2g磷酸二氢钾及10g蛋白腺，混合使Z溶解，用蒸饰水补充至1OOOmL,调节溶液pH值至7.2—7.4。趁热川脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250或500mL锥形瓶内，于121°C高压灭菌15min,贮于冷暗处备用。（2）平1111培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（

6、0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平川I内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。5、革兰氏染色剂（1）结晶紫染色液（2）碘与碘化钾——助染剂（3）脱色剂：95%乙醇。（4）沙黄复染剂测定步』4.1水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、ImL、O.lmL

7、。受污染水样接种量根据污染程度接种ImL、0.1mL.O.OlmL或O.lmL、O.OlmL、0.001mL等。使用的水样量可参考下表1。4.2总大肠群测定步骤表1接种川水量参考表水样种类检测方法接种量（mL）100501010.110210*310’10*5井水多筲发酵法XXX河水、塘水多管发酵法XXX湖水、塘水多管发酵法XXX城市原污水多管发酵法XXX如接种体积为10mL,则试管内应装三倍乳糖蛋白月东培养液5mL,如接种量为lmL或少于ImL,则町接种于普通浓度的乳糖蛋白豚培养液10mL中。4.2.1生活饮用水

8、（1）初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋门陈培养液的人试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样lOOmL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白月东培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL,混匀后置于37°C恒温箱内培养24h。（2）平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发