资源描述：
《内源脱落酸实验指导》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、一、实验材料、仪器和试剂1.材料新鲜植物材料2.仪器设备研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96孔酶标板，可调微量液体加样器(10UL,40PL,200UL,1000uL),带盖瓷盘(内铺湿纱布)。3・试剂(1)包被缓冲液:称取1.5gNa2CO3,2.93gNaHCO3,0.2gNaN3(可不加)，用量筒加1000mL蒸憎水，pH为9.6。(2)磷酸盐缓PP液(PBS)：称取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4,2.96gNa2HPO4・12H2O,用量筒加
2、1000mL蒸憾水,pH为7.5。(3)样品稀释液:500mLPBS屮加0.5mLTween-20,0.5g明胶(稍加热溶解)。(4)底物缓冲液:称HZ5.10gC6H8O7-H2O(柠檬酸),18.43gNa2HPO4-12H2O,用量筒加1000mL蒸憎水溶解,再加1mLTween-20,pH为5.0。(5)洗涤液：lOOOmLPBS加1mLTween・20。⑹终止液：2mol/L硫酸。(7)提取液：80%甲醇，内含1mmol/LBHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解BHT
3、,再配成80%的浓度。否则BHT难溶解)。(8)各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(间接和简化I'可接酶免疫测定用试剂)。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物(直接酶免疫测定用试剂)。二、实验步骤1.样品中激素的提取(1)称取0.5-1.0g新鲜植物材料(若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20°C的低温冰箱屮)，加2mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10mL试管，再用2mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4°C冰箱中
4、。⑵4°C下提取4h,1000g离心15min(实验中离心机型号LDZ5-2,约4000rpm),取上清液。沉淀中加1mL提取液，搅匀，置4°C下再提取1h,离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。⑶上清液过CJ8固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇(1mL)平衡柱一上样一收集样品一移开样品后用100%甲醇(5mL)洗柱-100%乙噬(5mL)洗柱一100%甲醇(5mL)洗柱一循环。(4)将过柱后的样品转入5mL塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容(一般0.5
5、g鲜重用1.5-3.0mL左右样品稀释液定容)。2.样品测定(I)包被：在10mL包被缓冲液中加入一定量的包被抗原(最适稀释倍数见试剂盒标签),一、实验材料、仪器和试剂1.材料新鲜植物材料2.仪器设备研钵，冷冻离心机，氮气吹干装置，酶联免疫检测仪，吸水纸，恒温箱，冰箱，96孔酶标板，可调微量液体加样器(10UL,40PL,200UL,1000uL),带盖瓷盘(内铺湿纱布)。3・试剂(1)包被缓冲液:称取1.5gNa2CO3,2.93gNaHCO3,0.2gNaN3(可不加)，用量筒加1000mL
6、蒸憎水，pH为9.6。(2)磷酸盐缓PP液(PBS)：称取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4,2.96gNa2HPO4・12H2O,用量筒加1000mL蒸憾水,pH为7.5。(3)样品稀释液:500mLPBS屮加0.5mLTween-20,0.5g明胶(稍加热溶解)。(4)底物缓冲液:称HZ5.10gC6H8O7-H2O(柠檬酸),18.43gNa2HPO4-12H2O,用量筒加1000mL蒸憎水溶解,再加1mLTween-20,pH为5.0。(5)洗涤液：lOOOmLPBS加1mLTwee
7、n・20。⑹终止液：2mol/L硫酸。(7)提取液：80%甲醇，内含1mmol/LBHT(二叔丁基对甲苯酚为抗氧化剂，先用100%甲醇溶解BHT,再配成80%的浓度。否则BHT难溶解)。(8)各激素包被抗原、各激素抗体、激素标准物和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(间接和简化I'可接酶免疫测定用试剂)。各激素抗体、激素标准物和各激素酶标物(直接酶免疫测定用试剂)。二、实验步骤1.样品中激素的提取(1)称取0.5-1.0g新鲜植物材料(若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20°C的低温
8、冰箱屮)，加2mL样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10mL试管，再用2mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4°C冰箱中。⑵4°C下提取4h,1000g离心15min(实验中离心机型号LDZ5-2,约4000rpm),取上清液。沉淀中加1mL提取液，搅匀，置4°C下再提取1h,离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。⑶上清液过CJ8固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇(1mL)平衡柱一上样一收集样品一移开样品后用100%甲醇(5mL)洗柱-100%乙噬(5mL)洗柱一100%
