发酵染菌的检查

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1、染菌的检查、原因分析和防止措染菌的检查、原因分析和防止措施仁染菌的检查与判断在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种：（1）显微镜检查通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据*产菌•朵菌的特征区別,判断是否染菌。必要时，可进行芽砲和鞭毛染色。（2）平板划线培养或斜面培养检杳法先将经灭菌的固体培养棊倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。将需要检查的样品，在

2、无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用虽。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样甜混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12-20h培养，观察有无噬菌斑。培养基（PH7.0）匍萄糖（％）牛肉膏（％）蛋白月东（%）氯化钠（％）琼脂（％）上层0.51.01.00.51.0下层0.51.01.00.52.0(3)肉汤培养检杳法将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基屮，放置摄氏3

3、7度和摄氏27度分别培养24h,进行观察，并取样镜检。此法常用丁•检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%,匍萄糖0.5%,氯化钠0.5%,蛋⑷东0.8%,1%酚红溶液0.4%,PH72用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。除以上方法外，还可以从发酵过程的界常现象來判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中C02含量和菌体酶活力等变化来判断。2发酵染菌率和染菌原因分析(1)发酵染菌率发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。发酵染菌是在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后被挽救不了导致倒

4、罐的批数，但种了罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。(2)染菌原因分析在发酵染菌Z后，必须分析染菌原因，总结发酵染菌的经验教训，把发酵染菌消灭在发生Z前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的最重耍措施。造成发酵染菌的原因很多，但总结归纳起來，其主耍原因有:无菌空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失课和技术管理不善。在发生染菌后，根据无菌试验结果，参考以下方法进行分析，找出原因，杜绝污染。(A)从染菌时间来看，发酵早期染菌，可能原因有：种了带菌，培养基和设备灭菌不彻底，接种操作不当，无菌空气带菌；发酵后期染菌，可能原因冇：中间补料污染，设备渗漏，操作问题。(B)从污染的杂

5、菌种类来看，污染耐热的芽砲杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；污染球菌、无芽抱杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌，设备渗漏；污染霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题。(C)从染菌的幅度来看，如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌，而且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题；如果各别罐连续染菌，一般是设备问题。以上仅仅是在分析问题时作为考虑问题的入门，应根据具体情况综合分析，且通过进一步的无菌检查来验证。3.杂菌污染途径及预防（1）种子带菌及防止种子带菌的原因主耍有以下几方而（A）培养基及用具灭菌不彻底菌种培养基及用具火菌均在火菌锅屮进行，造成火菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完全，造成假

6、压，使灭菌时温度还达不到要求。（B）菌种在移种过程屮受污染菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行。当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。因此，要严格无菌室管理制度和严格按无菌操作接种，合理设计无菌室。（C）菌种在培养过程或保藏过程［I'受污染菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有-淀长度，培养和保藏温度不宜变化太人。每一级种了培养物均应经过严格检杏，确认未受污染才能使用。（2）无菌空气带菌及防止无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的

7、设计，过滤介质的选用和装填，过滤介质的灭菌和管理等方血完善空气净化系统。（3）培养基和设备火菌不彻底导致染菌及防止培养基和设备灭菌不彻底的原因，主耍与以下几个方面有关（A）原料形状—般稀薄的培养基容易灭菌彻底，而淀粉质原料，特别是有颗粒时，容易山于灭菌不彻底,造成染菌。淀粉质培养基灭菌以采用实罐灭菌为好，在升温时先搅拌混合均匀，并加一定量的淀粉酶边加边液化。（B）实罐灭菌时未充分排除罐内空气实罐灭菌时，罐内空气未完全排除，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到灭菌要求