初始污染菌检测指导书

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1、初始污染菌检测指导书1.目的检测成品初始污染菌是否符合要求2.适用范围适用于未灭菌的成品检验3.职责和权限检验员实施本操作规程，质量控制室主管负责监督本规程实施。4.内容微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。4.1仪器、设备恒温水浴培养箱、洁净工作台、微生物限度检测仪、电子天平、压力蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、三角烧瓶、试管、无菌镶子、无菌剪刀、试管架、培养皿4.2培养基的配制营养琼脂培养基：称取本品32g,加1L纯化水，加热溶解，121°C高压蒸汽灭菌15m

2、in,将灭菌后的营养琼脂培养基冷至50±5°C,在层流净化台上倒入已灭菌的培养皿中，15-20ml/皿，备用。4.3计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的均应检查。4.3.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。(1)大肠埃希菌(Escherichiacoli)tCMCC(B)44102〕(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕(3)枯草芽孑包杆菌(Bacillussubtilis)CCMCC(B)6

3、3501〕(4)白色念珠菌(Candidaalbicans)CCMCC(F)98001〕(5)黑曲霉(Aspergillusniger}CCMCC(F)98003〕4.3.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽彳包杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孑包梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18〜24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24-48小时。上述培养物用0・9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50-lOOcfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5~7天，加入3-5ml含

4、0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将胞子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孑包子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0・9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孑包子数50〜100cfu的孑包子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8°C，可在24小时内使用。黑曲霉孑包子悬液可保存在2~8°C,在验证过的贮存期内使用。4.3.3适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孑包杆菌各50~lOOcfu,分别注入无菌平皿中，立即倾注营养培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30~35°C培养48小时，计数；取白色念珠菌

5、、黑曲霉各50-lOOcfu,分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23~28°C培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。4.3.4结果判定若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合观定。4.4稀释液制备方法pH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液取本品16.09g,加11蒸馅水，加热溶解，分装，121°C高压灭菌15min,备用。5.供试品检查5.1抽样一般同一批产品检验10个单位供试品。5.2试验过程4.2.1用75%的酒精

6、擦拭超净工作台后，开启紫外照射30mino4.2.2待检测品的外表面用75%的酒精喷洒后，放入超净工作台中。5.2.3撕开待检品的包装，用已灭菌的锻子夹住待检品，将待检品直接放入盛有适量PH7.0氯化钠-蛋白月东中浸没，振摇数次。4.2.4将制备好的供试液采用薄膜过滤法过滤，用供试液冲洗滤膜表面（滤膜孔径应不大于0.45mm,直径约为50mm）,并确保供试液完全覆盖滤膜表面。5.2.5取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上，同时做一个空白对照。5.2.6倒置于30~35°C恒温水浴培养箱内培养3天，观察并记录结果，空白应无菌生长，若空白有菌生长该试验视为无效。4.3结果报告菌落呈片状生长的平

7、板不宜采用：计数符合要求的平板上的菌落，当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。