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1、新生小鼠早期性别的快速鉴定1牛永东，石刚刚汕头大学医学院药理教研室,汕头市新陵路22号，515041［摘要］目的：快速鉴定新生小鼠的性别。方法：根据GenBank上Sry(sex-determiningregionofY-chromosome)的序列，设计小鼠的mSry引物,盲法对10只新生小鼠(〈7口龄)及6只已知性别的小鼠抽提鼠尾DNA,并进行PCR性别鉴定。结果：雄性小鼠尾组织DNA样品中扩增出了1条91bp的DNA片段，雌性小鼠DNA样品没能有效扩增出特异的SryDNA片段。结论：利用PCR检测鼠尾中的mSry是一简便快捷、有效的新生小鼠早期性别鉴定手段。中图分类号：S8
2、65.1文献标识码：B关键词：PCR；性别鉴定;小鼠原发性肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)是我国及世界范围内常见的恶性肿瘤，其发病机制迄今为止尚不清楚。原发性肝细胞癌HCC病因学认为，乙肝病毒(HBV)感染和包描黄曲霉毒素(AFB1)在内的化学因素摄入是肝细胞肝癌发生的两大主耍因素，且两者之间具冇明确的协同作用1'3o然而，二者间交互作用的分了机制不清。流行病学调查发现：男性IICC发病率是女性的3-5倍；50岁以下男性中HCC发病率高达女性的7-10倍。因此，性别差异是HCC病因学研究屮一・个不可忽视的重要影响因素。因此，包括黃曲霉毒素(AFB
3、1)在内的化学致癌物暴露诱导HCC的动物模型以雄性为多见。本试验采用PCR对新牛幼鼠(7日龄内)进行性别鉴定，旨在建立一简单、快速鉴定新生个体性别的方法。1资料与方法1.1新生幼鼠基因组DNA的提取新生7日龄以内的未知性别的幼鼠10只，分别剪去鼠尾2-3mm,置于1.5mL的EP管中，加入80(nlNaOH•EDTA溶液，沸水浴60min,加入80glTris-HCl溶液，吹打混匀，离心后取2口上清作为PCR模板。1・2引物设计根据小鼠Sry基因序列(GT：200873),用NCBI/Primer-BLAST(Primer3online)设计引物mSryoForwardprime
4、r：AGCTGTCTTGACTAATCGTAGTTC；Reverseprimer：TGCATGAGTACTGACTTGTATCTG。1.3PCR及电泳鉴定采用2XPCRM1X,20口体系屮加入DNA模板2卩1。反应程序：95°C预变性2min；95°C变性30Sec,59°C退火30Sec,72°C延伸20Sec,35个循环；72°C延仲5mino2%的Agarosegel,90V,15mino凝胶成像系统检测拍照。2结果2.1鼠尾DNA的质量控制新生7日龄以内的幼鼠鼠尾进行DNA提取与PCR扩增实验,做2个实验重复，用小鼠f3-Actin引物进行PCR实验后,10HlPCR产物
5、的琼脂糖电泳结果,离心柱型动物组织基因组试剂盒提取DNA做扩增阳性对照。由图1可见，新生7H龄以内的幼鼠鼠尾DNA可以用于下一步的PCR鉴定。2.2性别鉴定用所设计的n)Sry引物对10只7日龄内的新生幼鼠和已知性別的小鼠进行鉴定，雄性DNA样品可扩增91bp的mSry基因片段，而雌性DNA样品中未见特异的mSry基因片段。由图2可知，1,2,4,5,8号是雌性；3,6,7,9,10号是雄性。此外，对6只已知性别的小鼠进行了鉴定，正确率为100%。3讨论有关HCC动物模型有很多，主要包括灵长类、大鼠、兔了、树齣、土拨鼠、旱獭、金黄地鼠、北京鸭等。但兼顾考虑病W(HBV)感染和化学
6、致癌物协同作用、HCC显著的性别差异等因素，以及试验费用和HBV病毒宿主局限性等原因，H前化学致癌物暴露诱导的IICC动物模型仍多选择小鼠。由于成年小鼠对AFB1等化学致癌物的肝毒性多不敏感(多数情况下，小鼠多不自发肝细胞癌)；但新生小鼠，尤其是新生7日龄内的幼鼠，由于其和关代谢酶系尚未发育成熟，也被用于化学致癌物AFB1等的诱导成瘤实验。目前新生仔鼠性别鉴定，主要在离乳后依据生殖器与肛门Z间的距离长短及肛门与生殖器有无被毛等为标志。因而，不能满足新生7□龄以内的幼鼠性别的要求，
7、大I此，及早获得新生仔鼠性别就显得比较重要，利用PCR对新生个体进行性别鉴定，然后再根据需耍进行选择
8、性处理。木研究中利用碱裂解法快速得到组织DNA,同时使用常规PXR获得特界的PCR产物，说明本套技术是一简便、快捷、且有效的手段。但鉴于PCR假阳性和假阴性的考虑，建议实验中一定要设立特异的阳性和阴性对照，以避免实验中出现的假性结果；其次，实验操作过程中要尽量避免交叉污染。参考文献：[1JQianGS,RossRK,YuMC,YuanJM,GaoYT,HendersonBE,WoganGN,GroopmanJD.Afollow-upstudyofurinarymarkersofa
