高通量测序在遗传病临床基因检测中的效果评价

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1、万方数据《中国产前诊断杂志(电子版)》2016年第8卷第4期高通量测序在遗传病临床基因检测中的效果评价·专家笔谈·5张彦k2吴柏林2’3。(1．广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州511442；2．哈佛大学医学院波士顿儿童医院实验医学部；3．复旦大学儿科医院、复旦大学生物医学研究院，上海200433)【摘要】基于国内外迅猛发展的高通量测序技术(第二代测序技术)应用以及精准医学的需求，从技术和成本角度分析高通量测序技术用于同时检测单核苷酸变异(SNV)和拷贝数变异(CNV)的临床应用价值。【关键词】高通量测序；拷贝数变

2、异；单核苷酸变异；基因诊断【中图分类号1R714．55【文献标识码】A高通量测序技术(highthroughputsequencing)也叫做第二代测序或下一代测序(nextgenerationsequencing，NGS)，由于其较高的检测效率而得到越来越多的推广和应用。但由于技术发展的局限和生物信息学的限制，临床应用尚存在着较多的结果可重复性问题和数据解读困难。本文就高通量测序技术在临床应用方面的实用性做一综述，拟对其同时检测拷贝数变异(copynumbervariation，CNV)和单核苷酸变异(singlen

3、ucleotidevariation，SNV)的效能进行客观评价。1NGS简介NGS技术的发展目前大致可归结为3个方向。第一个方向可追溯到1990年的大规模平行测序技术(massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)[1]，由于其技术极其复杂而使其应用受限。2004年与Solexa公司合并，而后者是基于1998年出现的另一技术一可逆染料终止技术(reversibledye—terminatortechnology)[23，后来被Illumina公司兼并，最终发展为现在的边合成边测序

4、技术；第二个方向起始于2005年的聚合酶克隆测序技术(po—lonysequencing)[3]，后来整合入AppliedBiosys—doi：10．13470／i．cnki．cjpd．2016．04．002*通讯作者：吴柏林，E—mail：bailin．WU@childrens．harvard．eduterns公司的SOLiD平台，并最终相继被LifeTech—nologies和ThermoFisherScientific公司并购，发展为现在的半导体测序技术；第三种为焦磷酸测序技术，出现于2005年，后被RocheD

5、iagnostics公司并购。还有一些其他高通量测序技术得到过推广，比如纳米球测序技术(DNAnanoballsequencing)H]被CompleteGenomics公司利用开发，后被华大基因并购；单分子荧光测序技术由HelicosBiosciences公司开发，但该公司很快破产；单分子实时测序(singlemoleculerealtimesequencing)[51由PacificBiosciences公司开发；另外，有些高通量测序技术仍处于研发阶段或初步使用，如纳米孔测序技术(NanoporeDNAsequen

6、cing)、微流控Sanger测序等‘6，7

7、。就目前已经在临床应用的几种高通量测序技术，按其技术原理和优缺点简单归纳如表1。2NGS同时检测SNV和CNV的临床应用尝试自从高通量测序技术诞生开始，科学界对于各种遗传变异的检测要求就在不断提高，包括大到染色体数目和结构，基因组微缺失微重复等的变异(如21一三体综合征、猫叫综合征)、不同长度片段拷贝数／CNV的变异(如a地中海贫血、DMD)，小到单个万方数据6·专家笔谈·《中国产前诊断杂志(电子版)》2016年第8卷第4期表14种高通量测序技术比较或数个碱基对／SNV的变

8、异(如结节硬化症、成骨不全症)都可以导致遗传病。因此在同一平台同时检测各种致病基因突变(检测SNV)或基因组失衡(检测CNV)就成为遗传病基因诊断的必然要求，尤其对于罕见遗传病。目前的高通量测序技术对于检测单个或少数几个核苷酸变异(SNV)一般不存在太多问题，各大主流测序平台(如Proton和Nextseq550等)均可以检测外显子组或人基因组，检测准确性一般均可达到99％以上。对于拷贝数变异(CNV)和染色体微小结构变异(structuralvariation，SV)等的检测却不尽如人意，主要问题出现在成本效益比太低

9、、特定染色体区域的捕获效率较差，以及短读长拼接错误。针对不同检测方案的检测效率大致可以分为如下几类：2．1基于外显子组测序(wholeexomesequencing，wEs)的尝试针对目前已知的约2万个基因的所有编码外显子及两端侧翼序列进行捕获后测序。该方案优点是成本相对较低，而且将绝大多数已知致病基因的突变位点囊括在内，可以一次