HisTag_融合蛋白纯化(默克新版)

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1、产品使用说明书His·Tag融合蛋白纯化操作手册采用pET系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到20mg/100ml培养物并不是困难的事。在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进行目的蛋白的细胞定位（请参考pET系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿

2、主菌、以及表达水平都有关系，可以通过选择不同表达载体和E.coli宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用NTAHis·Bind树脂或IDAHis·Bind树脂进行纯化。内容提要一、亲和纯化样品的前处理1.菌液体积-起始目的蛋白量2.细菌裂解获得可溶蛋白•BugBusterMasterMix蛋白抽提方法•机械破碎（如超声等）二、亲和纯化步骤Ni-NTA树脂纯化1.Ni-NTA树脂的兼容性2.天然条件纯化•柱层析•FPLC•批次小量纯化3.变性条件的纯化•柱层析•FPLC纯化•批次小量纯化4.树脂再生5.常见问题与

3、改善建议附录：补充背景知识•NTA和IDA化学基团•杂蛋白•His·Bind基质选择指南•如何降低非特异性结合•在确定裂解方法前的考虑•漂洗杂蛋白•蛋白可溶性及细胞定位•目的蛋白的洗脱•天然或变性条件下目的蛋白的纯化•纯化真核表达体系来源的His·Tag融合蛋白•批次小量纯化或柱层析纯化方法•His·Tag融合标签的去除•目的蛋白的结合•推荐资料默克生命科学服务热线：4008208872bioteam@merck-china.com一、亲和纯化样品的前处理1.菌液体积-起始目的蛋白量纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采用一

4、个较高的浓缩系数（concentrationfactor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。例如，某蛋白表达水平约为0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则100ml的培养物离心获得的菌体，按浓缩100倍比例重悬于含变性剂的1ml裂解/结合缓冲液中。在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用50-100倍浓缩。表1确定所需菌液体积His·Tag融合蛋白浓度表达水平培养体

5、积His·Tag融合浓缩系数蛋白总量（在1ml溶液中裂解后）变性条件50mg/L40%3ml150µg3×10mg/L8%10ml100µg10×2mg/L1.6%25ml50µg25×0.5mg/L0.4%50ml25µg50×0.1mg/L0.8%100ml10g100×天然条件>1mg/L>1%50ml>50g50×<1mg/L<1%100ml<100g100×与其它亲和纯化介质一样，His·Bind树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌TM抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDS-PAGE，Wester

6、nblot，S·TagTMRapidAssay，FRETWorksS·TagAssay等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。2.细菌裂解获得可溶蛋白•BugBusterMasterMix蛋白抽提方法BugBusterMasterMix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme™溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和500ml包装分别足够用于20g和100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。可溶蛋白制

7、备采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考Novagen的TB055“PET系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。1.用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml或更少），可以用1.5ml离心管14,000–16,000g离心。尽量倾