奶制品中维生素A和维生素E的测定

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1、奶制品中维生素A和维生素E的测定食品安全检验手册50页1.原理样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用外标法定量测定。最小检出量分别为：VA:0.8ng;α-E:91.8ng;δ-E:20.6ng。2.试剂实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。(1)无水乙醚：不含有过氧化物。(1)过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈

2、黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。(2)去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。(2)无水乙醇：不得含有醛类物质。(1)检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。(2)脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50

3、mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。(3)无水硫酸钠。(4)甲醇：重蒸后使用。(5)重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。(6)10%抗坏血酸溶液（m/V）：临用前蒸馏。(7)1：1氢氧化钾溶液。(8)10%氢氧化钠溶液（m/V）。(9)5%硝酸银溶液（m/V）。(10)银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止。再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水溶解。(11)维生素A标准液：视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇

4、溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。使用前用紫外分光光度计法标定其准确浓度。(12)维生素E标准液：α-生育酚（纯度95%），δ-生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上两种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于10mg。临用前用紫外分光光度计法标定此两种维生素E的准确浓度。3.仪器和设备(1)实验室常用设备。(2)高压液相色谱仪带紫外分光检测器。(3)旋转蒸发器。(4)高速离心机。(5)小离心管：具塑料盖1.5~3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）。(6)高纯

5、氮气。(7)恒温水浴锅。(8)紫外分光光度计。4.操作步骤(1)样品处理①皂化称取5g奶粉或50g牛奶（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg）于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直至颗粒物分散均匀为止。加5mL10%抗坏血酸，混匀。加10mL1：1氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。②提取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残

6、渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。③洗涤用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。④浓缩将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250~300mL球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，

7、充分混合，溶解提取物。⑤将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000rpm）。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。(2)标准曲线的制备①维生素A和维生素E标准浓度的标定方法取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如下表所示。1%标准加入标准的量S,μL比吸光系数Ecm波长λ,nm视黄醇10.001835325δ-生育酚1

8、00.092.8298α-生育酚100.071298浓度计算：A1.300X=××1−3E100S×10X--某维生素浓度，g/mL；1A--维生素的平均紫外吸光值；S--加入标准的量，μL；E--某种维生素1%比吸光系数；.300--标准液稀释倍数。−3S×10①标准曲线的制备视黄醇标准溶液精确称取视黄醇标准品5.0mg，用无醛乙醇稀释并定容至100mL，摇匀，即可。依法吸取此液300µL，加无醛乙醇稀释至3.0mL，并于λ=325nm处测得吸光度为0.904。按上页公式计算：按