资源描述：
《丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。2.范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。4.原理采用荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-
2、PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。5.样本要求5.1适用标本类型：血清5.2标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入无菌的真空采血管屮(未加抗凝剂)，室温(22-25°C)放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500ipm离心5min；吸取上层血淸，转移至1.5ml灭菌离心管。5・3标本保存和运送所釆集的标本可立即用于测试或长
3、期保存于・70°C,也可保存于・2(rc待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用干冰(或者冰袋)保持低温，运输时间不应超过4天。5.4拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。6.仪器和试剂6.1设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。6.2试剂生产厂家：屮山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/S7271-2013最低检出量：最低检出量为500IU/ml试剂各组分见表1：7.操作步骤表1试剂盒组分表组分名称规格数量核酸提取试剂RNA提取液A200ul/管1RNA提取液B5ml/
4、瓶2DEPCH2O3ml/瓶1PCR检测试剂HCV内标溶液100ul/管1HCV反应液A270ul/管1HCV反应液B30ul/管1质控品阴性质控品200ul/管1HCV强阳性质控品200ul/管1HCV临界阳性质控品200ul/管17・1试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程记录表上做相应记录。7.1.2PCR反应液配制7.1.2.1取出HCV反应液A、HCV反应液AB,室温溶化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用。7.1.2.2収出N个（N=待测样本
5、数+4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反应管，HCV单人份扩增体系配制见表2：表2PCR反应液配置表组分HCV反应液AHCV反应液B总体积用量/人份27ul3ul30ul将各组分充分混匀，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，Z后将30U1扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。7.1.375%乙醇配制:取2.25ml的DEPCH20,加入6.75ml的无水乙醇,振荡混匀，配制成75%乙醇，盖紧盖子，经传
6、递窗传递到标本制备区。7.2RNA提取（标本制备区）7.2.1进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管和75%乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。7.2.2从冰箱取出待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、RNA提取液A、RNA提取液B和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。723打开金属浴，调节温度为65°C,使仪器自动升温。7.2.4用蹑子夹取n个1.5ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。（n=待测样本数+3=待测样本数+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品）7.2.5向离心管中各加入10ul内标
7、溶液，再分别加入200ul样本，800ulRNA提取液B,盖紧管盖，振荡混匀15s以充分混匀，室温放置5min（每隔lmin旋涡振荡5s,使裂解更充分，处理结束后瞬时离心。）7.2.6加入200ul无水乙醇，盖紧管盖，漩涡振荡混匀15s以充分混匀，瞬时离心，再加入20ulRNA提取液A,漩涡振荡混匀5s,室温静置lmin。8000rpm离心lmin,小心吸弃上清。7.2.7再加入200ulRNA提取液B,盖紧管盖，充分混匀（用移液枪吹打），室温下8000rpm离心lmin,小心吸弃上清。7.2.8加预冷的75%乙醇400ul充分
8、混匀，8000rpm离心lmin,小心吸弃上清。7.2.9加预冷的75%乙醇400ul充分混匀，8000rpm离心lmin,小心吸弃上清。7.2.10打开管盖，放入金属浴，65°C干燥5min,使液体挥发完全。7.2.11温育5min后，用银子从金属浴中取出离心
