现代分子生物学 林可慧

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1、生物医学工程1202班林可慧研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：一、DNase1足迹实验二、甲基化干扰实验三、凝胶阻滞实验四、体内足迹实验五、拉下实验一、DNase1足迹实验1、概念:足迹实验（foot-printingassay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。2、原理：当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”

2、。3过程：(1).将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA(2).在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体(3).在反应混合物中加入少量的DNaseI,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNaseI消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不

3、间断的连续的DNA片段梯度群体；b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNaseI酶的降解作用；(4).除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:a、实验组：DNA+蛋白质混合物b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育(5).最后进行放射性自显影，分析实验结果。4、结果判断:实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。5、其他的足迹实验方法：除了DNase1足迹试验

4、之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a、自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。6、优缺点：a.优点：可以形象的展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过使用足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同的蛋白质因子

5、之间的结合位点的分布情况。也可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此可以确定其核苷酸序列的特异性。b.缺点：蛋白质浓度高时才有效，需要蛋白质纯化的操作。而且DNase1活性所需的氯化镁和氯化钙会破坏特异性的相互作用。二、甲基化干扰实验1、概念：甲基化干扰实验（Methylationinterferenceassay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。应用这种技术可以检测靶DNA中G

6、残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。2、实验步骤：(1).用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）(2).同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合(3).进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：a、其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带(4).将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为：a、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够

7、同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；b、不具有甲基化G残基的靶DNA序列则不会被切割（5）将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳(6).作放射自显影，读片并分析结果3、结果判断：a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢

8、吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。4、应用：a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系；b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置5、优缺点