学位论文范例：探究恶性疟疾疫苗的研制过程

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1、学位论文范例：探究恶性疟疾疫苗的研制过程我们知道，疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病,是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上约有20亿人口生活在疫区⑴•在我国，疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。2010年我国政府公布了《中国消除疟疾行动计划(2010-2020年)》，提出在2020年全国实现消除疟疾的目标［2］・因此，对中国以及全球来说，迫切需要研制预防疟疾的疫苗。疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加Z疟原虫的致病机理尚不十分清楚，这

2、些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。根据疟原虫在人体的生活史，可将疟疾疫苗分为3种，即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子抱子表血的环子砲子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame等⑶研究发现，在CSP蛋白中存在重复37次的Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)E9肽重复序列(NANPrepeatedmotif),该序列重复4次，而且这种重复无株间差异。Gerloni等［4・5］构建了包含3个重复的NANP四肽重复序列的IgG重链基因的重组质粒，并

3、用该质粒免疫小鼠后，在持续2年的时间内观察到机体产生了特异的抗NANP反应。Kubler-Kielb等⑹通过蛋白质水平的偶联技术，实现了将4或5个重复的NANP四肽重复序列与pfs25蛋白质自身聚体的物理连接，并将此复合物免疫小鼠，结果显示，小鼠体内可产生特异性的抗pfs25蛋白及抗CSP应答。基于CSP蛋白结构，美国葛兰素史克生物公司(GSK)研发了RTS?S/AS01恶性疟疾疫苗，2011年的初步研究结果显示，在为期12个月的观察期内，6000名5~17月龄幼儿注射3剂疫苗后，患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了56%和47%[7].这是

4、恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。NANP四肽重复序列仅是CSP蛋白质的一个结构区域，若开发针对该四肽重复序列的单克隆抗体，则可提供检测该序列的特异性和敏感性，有益于基于NANP四肽重复序列的各项基础及应用研究。因此，本实验以BSA(-NANP)5偶联蛋口为免疫原，利用经典杂交瘤技术，筛选出10株杂交瘤细胞株，为进一步的研究工作奠定基础。1材料与方法多肽及细胞(NANP)5多肽、(NANP)5C多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成，经HPLC纯化后纯度为95%,各合成50mg;SP2/0骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。1.2实验

5、动物SPF级BALB/c鼠，雌性，6~8周龄，体重12^14g,动物合格证号为:SYXK(甘2012-0002);清洁级F1鼠，雌性，体重16g以上,动物合格证号为：SYXK(廿20229003)，均由本公司动物实验室提供。1.3主要试剂RPMI1640、胎牛血清、黄嘿吟(hy・poxantin,HAT)、氨基蝶吟(aminopterin)和胸腺"密陀脱氧核昔(thymidin)培养基购自美国GIBCO公司;HRP、过碘酸钠(NalO4)、HRP标记的兔抗鼠IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰脐(adipicdihydrazi

6、de’ADH)、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺[l-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)CarbodiimideHydrochloride,EDC]购自美国Sigma公司;lmjectMa-leimideActivatedBSAKit购口美国ThermoScienti-fic公司;弗氏佐剂由本公司第四研究室制备;2(・N■吗卩林代)乙磺酸［2(-N-Morpholino)ethanesulfonicacidhydrat?MES］＞硫氧酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝R-250等为国产试剂。1.4抗原板条(NANP)

7、5及(NANP)5C多肽、戊型肝炎病毒(HEV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、睫状神经生长因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存;CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠⑻，并由本公司第四研究室制备抗原板条。1.5完全抗原的制备选择BSA作为载体蛋白，应用以下2种方法将(NANP)5或(NANP)5C多肽与载体蛋白偶联。方法1［马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联法：马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联，具体操作按ImjectMaleimid

8、eActivatedBSAKit试剂盒说明书进行：用lml的偶联缓冲液(0.083mol/Lsodiumphosphate/0.1mol/LEDTA/0.9mol/LNaCI/0.1mol/L