MSAP技术及其在动植物遗传育种中的研究进展【文献综述】

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1、毕业论文文献综述生物工程MSAP技术及其在动植物遗传育种中的研究进展摘要：DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它参与了基因表达、生长发育、逆境胁迫应答等过程，在基因表达的调控中具有重要作用。随着对DNA甲基化研究的深入，在AFLP技术基础上衍生的DNA甲基化敏扩增多态性技术（MSAP），以其高通量、高多态性、低成本、易操作等优点，在各个领域得到广泛应用。本文综述了该技术的基本原理与操作，及其研究现状。关键词：文蛤，DNA甲基化，MSAP技术前言文蛤（MeretrixmeretrixLinneus）又名花蛤，属于软体动物门、双壳纲、真瓣鳃目、

2、帘蛤科、文蛤属。其贝壳略呈三角形，腹缘呈圆形，壳质坚厚，两壳大小相等，喜生活在有淡水注入的内湾及河口附近的细沙质海滩上。文蛤肉嫩味鲜，是贝类海鲜中的上品，其中含有蛋白质10%，脂肪1.2%，碳水化合物2.5%，而且还含有人体易吸收的各种氨基酸和维生素及钙、钾、镁、磷、铁等多种人体必需的矿物质。文蛤是埋栖型贝类，大多分布在较平坦的河口附近沿岸内湾的潮间带，以及浅海区域的细沙，如辽宁辽河口、山东黄河口、江苏长江口、广西北海湾等地自然资源丰富。目前，我国文蛤主产区如东县沿海地区大约有35万亩海滩的养殖规模，年产有3万吨左右。文蛤的全人工育苗技术在我国已有

3、新的突破，但至今工厂化育苗尚未形成生产能力。靠工厂化育苗提供大量商品文蛤苗种，目前尚有困难。苗种来源主要依靠采捕自然苗或半人工采苗。以拦网与耙滩相结合的文蛤半人工采苗既简便，又易操作，成本又低，这一采苗方法是可行的，值得推广。1.DNA的甲基化及其分析方法DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它参与了基因表达、生长发育、逆境胁迫应答等过程，在基因表达的调控中具有重要作用。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶(SmC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG岛上。CpG岛是CpG二联核苷富集区域，CG含量大于50％，长约200—500bp。哺

4、乳动物DNA甲基化的模式只有5mC这一形式，真核生物中大约2％一7％的胞嘧啶被甲基化修饰。早期的基因组DNA甲基化分析技术，如SssI甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来常用的基因组甲基化分析方法有两种：甲基化敏感扩增多态性(methylationsensitiveamplificationpolymorphism，MSAP)技术和高效液相层析(highperformanceliquidchromatography，HPLC)。位点特异性DNA片段甲基化检测方法有：限制酶PCR、甲基化特异性P

5、CR（MSP）、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)、结合亚硫酸盐限制性分析法(COBRA)、DHPLC、Methylight、微阵列法。本次实验是应用MSAP技术对文蛤四种壳色的DNA甲基化分析，检测它们的甲基化多态性，分析它们的甲基化模式，了解文蛤的甲基化水平，从而为建立文蛤不同壳色鉴别的分子标记奠定基础。2.MSAP技术的原理及其方法MSAP是在AFLP技术的基础上，用识别5-CCGG序列的限制性内切酶HpaII和MspI代替AnP技术中识别4碱基的内切酶MseI建立起来的新技术。该技术由Reyna-Lopez等于1997年首次报

6、道，并被用于检测二形真菌的DNA甲基化，之后被用于检测水稻基因组胞嘧啶甲基化，目前该技术已在油棕、柑橘、高粱、棉花、拟南芥、香蕉、玉米等植物上得到成功应用。2.1MSAP技术的原理采用HpaII和MspI，分别与识别6碱基的EcoRI配对组合对基因组进行酶切，然后再加上相应的限制性内切酶的接头，利用接头序列设计引物，对5-CGG位点甲基化进行特异性扩增。尽管HpaII和MspI都能识别相同的位点，但两者对DNA甲基化敏感程度存在很大的不同。根据HpaII和MspI对基因组DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以扩增出不同的谱带，可以检测出其总甲基化水平

7、以及有效区分出基因组DNA的全甲基化(双链甲基化)和半甲基化(单链甲基化)等甲基化状态。2.2MSAP分析的技术流程MSAP技术与AFLP技术类似，其主要包括DNA的提取、纯化、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、记带和数据整理等步骤。2.2.1高质量DNA制备DNA提取可以采用CTAB法或SDS法大量制备，再采用苯酚-氯仿抽提法纯化，然后检测DNA质量与浓度，取部分原液稀释备用。2.2.2酶切与接头连接分别用酶组合EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI消化DNA稀释液，酶切反应在37℃水浴中进行，一般为了保证消化

8、彻底，需酶切6小时或过夜。然后90℃水浴10分钟让限制酶失活，再加入接头和连接酶反应3小时。由于HpaII和MspI对CC