[精品]铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定

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1、铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定[摘要]右斛生境中存在多种能够促进右斛生长的内生真菌，利用内生真菌与铁皮右斛组培苗共生培养，筛选对铁皮右斛组培苗有促生长活性的内生真菌，研究内生真菌对石斛根的侵染情况，采用形态鉴定和分子鉴定的方法对促生长活性内生真菌进行鉴定。结果表明,8株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长作用，均能侵染铁皮右斛根，在铁皮石斛根的根被、外皮层、皮层中以菌丝或菌丝团的形式存在，不侵染内皮层和中柱，区别于有害真菌。8株活性内生真菌中，2株产抱真菌经形态鉴定，属于Pestalotiopsis,

2、Eurotium属，6株不产孑包真菌经分子鉴定，分別属于Pyrenochaeta,Coprinellus,Pholiota,Alternaria,Helotiales等5个属。促生长活性内生真菌与石斛组培苗共生培养，可促进右斛组培苗生长，对于缩短石斛生长周期，增加石斛中药材资源具有指导意义。[关键词]铁皮石斛；内生真菌；促生长活性；侵染检测；菌种鉴定铁皮石斛Dendrobiumofficinale是常用名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效。市于石斛的自然繁殖率低,对环境条件要求较严格，产区药农长期采挖，自然资源已濒临灭绝。虽然

3、右斛组织培养体系已成功建立，可大量繁殖石斛组培苗，但组培苗移栽成活率低，生长缓慢，成为冇斛组培苗人工栽培的瓶颈。兰科植物与真菌能够形成典型共生关系，内生真菌或菌根真菌对兰科植物种子萌发、生长、成苗具有重要的促进作用。相同生境下的不同兰科植物有着相似的菌根真菌，而不同生境的同一兰科植物有不同的菌根真菌，两者间的共生关系是非专一性的^[1]o范黎等〈sup>[2]发现不同的真菌可促进同一种兰科植物的种子萌发，同一真菌也可与一种以上的兰科植物的种子形成共生关系。郭顺星等^[3]分离的2

4、株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长的活性。吴慧凤等^[4]也获得了9株对铁皮石斛有促生长作用的内生真菌。本试验探讨石斛属植物的内生真菌对铁皮石斛苗的作用，以期获得对石斛苗有促生长活性的内生真菌,为人工栽培石斛和组培苗移栽成活提供新的技术手段和理论基础。1材料植物材料为铁皮石斛组培苗。内生真菌为分离口石斛属植物的36株内生真菌，由屮国医学科学院药用植物研究所真菌室保存。PDA培养基：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂12g,水1L；组培培养基：1/2MS（大量成分减半），马铃薯200g,蔗糖30g,活性炭2g,琼脂7

5、.5g,水IL,pII5.8；共生培养基:1/2MS（大量成分减半），蔗糖7.5g,琼脂7.5g,水IL,pII5.8o2方法2.1内生真菌的培养内生真菌接种于PDA培养基上,25°C黑暗培养10do2.2铁皮石斛组培苗的培养将铁皮石斛组培苗继代于组培培养基上，在培养温度（昼/夜）25°C/18°C、光照周期12/12h、光强2000lx的条件下培养，至铁皮石斛苗长到4〜6叶期。2.3共生培养取4〜6叶期、生长一致的铁皮石斛组培苗接种至含有50n）L共生培养基的三角瓶中，每瓶接种1株，将1片宜径6mm菌片接种在距苗1cm处，对照接

6、种1片•直径6mm的PDA培养基。置于培养温度（昼/夜）25°C/18°C、光照周期12/12h、光强2000lx的条件下培养45do2.4促进铁皮石斛苗生长的内生真菌的筛选共生培养结束后，根据植株形态指标衡量内生真菌的作用，去掉病苗、死苗，统计成活苗的株高、茎粗、分篥、生根等的形态指标筛选出有促生长活性的内生真菌。2.5内生真菌对铁皮石斛苗侵染的检测共&的铁皮石斛苗根系以流水冲洗干净，切成0.5cm小段，FAA溶液固定，石蜡包埋，切片,番红I古I绿对染，加拿大树胶封片，光学显微镜下观察。2.6促生长活性内生真菌的鉴定2.6.1形

7、态鉴定对产鞄内生真菌的培养特性、显微形态特征进行观察，依据萨卡图（Saccardo）和休斯-塔巴基-巴伦（Hughes-Tabaki-Barron）真菌分类系统进彳亍鉴定，分类检索参照文献[5-7]o2.6.2分子鉴定对不产抱内生真菌依据rDNA的内部转录间隔区（ITS）序列进行分子鉴定。内生真菌DNA提取采用CTAB法^[8],用通用引物ITS1：（5/-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3Z）,ITS4：（5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-37）[9]扩增ITS1,5.8S和ITS2的全

8、序列。PCR反应体系50uL：1XPCRbuffer,MgC123mmol•L^-l,4种dNTP各200mmol・L^-l,上下游引物各0.3umol-L^-l,Taq酶2.0U,DNA