[精品]蛋白质相互作用研究方法

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1、2.1酵母双杂交该系统由Fields和Song［3］首先在研究真核垄因转录调控时建立。利用真核牛•长转录因了的两个不同的结构域DNA结合结构域（DNAbindingdomain）和转录激活结构^（transcription-activatingdomain）,分别与目标蛋白X及可能与目标蛋白相耳作用的蛋白丫相连，并共同转入酵母细胞。如果蛋白X与丫能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因。通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋口是否发生相互作用［4-5］o这一经典的蛋

2、白相互作用研究方法接近丁•体内环境，那些瞬吋、不稳定的两两相互作用也可以被检测到，并且与内源蛋白的表达无关［6］。鉴于这些优点并结合简便高效的Gateway表达载体构建方法［7］,在人规模的蛋口质一蛋口质相互作川研究屮酵母双杂交系统得到了最为广泛的应用。Rain等［8］用该法绘制了人类胃肠道病原菌Helicobacterpylori的人规模蛋白质相互作用图谱。在261种蛋白中，确立了1200种相互作用关系，涵盖了整个蛋白质组得46.6%0随后，Giot等［9闭ILi等口0］在果蝇和线虫屮也成功地研究了大规模的蛋白质相

3、互作川。除了对模式生物的研究外，Stelzl等［⑴和Raul等［12］则先后分析了人脑组织、人已知ORF屮人规模的蛋白质相互作川网络。但酵母双杂交方法本身也有一定的局限性：⑴不能研究具有自激活特性的蛋口质；（2）只能检测两个蛋口间的相互作用；（3）检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；（4）大部分实验中冇将近50%的假阳性率，且推测的相互作用仅有3%在两种以上的实验屮得到验证。为了弥补方法本身的缺点及局限性，研究者也不断地对其进行完善和改进。Stelzl等［馅］在研究中就采用了以卜.

4、的策略：（1）选择不同功能、不同大小的蛋白作为诱饵，以确保所选靶蛋白在整个蛋白质纟fl屮的代表性；（2）筛选过程屮采用两伦杂交的方法：第一伦以混合诱饵（8个）对文库进行筛选，结果呈阳性的克隆再进行一对一的第二轮杂交，这样既降低了工作量乂提高了结果的准确性；（3）pull・down,免疫共沉淀对酵母双杂交的结果进行体内的相互作用验证；（4）利用牛物信息学的方法对结果进行系统分析，包括基因的染色体定位、蛋白质作用网络的拓扑结构分析等，从多方而分析结果的可信度。据此，他们最终确认了911对高可信度的相互作用涉及到401种蛋

5、白，数据分析屮设立了6个标准来判定得到的结果，人人提高了酵母双杂交实验结果的可信度。牛物秀•专心做牛物22串联亲和纯化Rigaut等［13］首次采用串联亲和纯化技术（tandemaffinitypurification,TAP）研究了蛋白间的相互作用，与其他融合标签方法的授大不同是该方法选用了两个连续的标签而不是通常意义上的一个。标签共分三部分：蛋口A、CBP（calmodulinbindingpeptide,钙调索结合多肽）和屮间连接的TEV酶识别的酶切位点。带有TAP标签的融合蛋白在细胞屮表达与内源札I互作用蛋白

6、形成复合物，细胞裂解后经IgG偶联的层析柱纯化，蛋白A与IgG特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为了除去与柱填料非特界结合的蛋白，用TEV猶切割分离蛋白A标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行笫二次纯化，靶蛋口上的CBP标签可与钙调索结合；在加入过量螯合剂EGTA后CBP与亲和层析柱分离使含有靶蛋口的复合体得到分离纯化，经SDS-PAGE,复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列（图1）。该方法的优点：⑴不需要过多的背景知识

7、就可以得到大量含靶蛋白的复合体:（2）蛋白表达及与复合物的结合都接近半理水平，是一种检测体内蛋白和互作用的方法；（3）TAP采用两步亲和纯彳匕提高了纯化产物的特界性。一般在2L的酵母培养基中（细胞湿重约10g）可以分离纯化得到足够一维电泳及质谱分析的蛋白复合物［15］oGavin等［16］采用TAP结合质谱鉴定，对啤酒酵母的多蛋口复合物进行了大规模的研究。共分析了1739个基因其中与人类基因相关的有1143个，纯化了589种蛋白，经生物信息学分析，它们分属于232个不同的多蛋白复合体；在细胞中具有新功能的为344个，

8、231个蛋口的功能以前未见报道。由于TAP/MS方法的高灵敏性使得仅有15个拷贝的蛋白也能被检测到，鉴定的蛋白分子量从6.6kDa到559kDa,等电点从3.9到12.4。这一研究提供了真核生物中二元以上的蛋白相互作用网络从屮得到的有关其功能的各种信息也能为药物的筛选提供依据。TAP技术的出现有效地促进了酵母中大规模的蛋白鉴定和纯化工作，但是其