蛋白质的相互作用研究方法

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1、两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。使蛋白质到发挥作用的位点。使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。第三节蛋白质的相互作用的研究方法免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GSTpull-downassay荧光共振能量转移FluorescentResonantEnergyTransfer（FRET）双分子荧光互补（BimolecularFluorescentComplement）BIFC酵母双杂交系统

2、YeastTwo-HybridSysterm其它方法1.原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用一、免疫共沉淀2.方法1)收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3)12000rpm离心30min4）收集上清并加入适

3、量抗体，4ºC摇动1h～过夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液，4ºC摇动1h6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液7）离心弃上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）离心，上清液跑SDS-PAGE胶10）考马氏亮兰染色、银染WesternBlot质谱分析3.注意事项1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS

4、)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3)对照实验的设计。二、GST融合蛋白进行Pulldow实验1原理细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。两种应用：1）确定融合（或探针）蛋白与未

5、知（或靶）蛋白间的新的相互作用2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用2方法：1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4ºC2h3）离心弃上清4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，离心5）取上清进行SDS-PAGE电泳，6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行GST-Pu

6、lldownAssay三、Fluorescenceresonanceenergytransfer荧光信号的产生荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。什么是FRET?当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。3.绿色荧光蛋白60年代，Shimomura等首先从水母（AequoriaVictoria）中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与

7、钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。OsamuShimomuraOsamuShimomurainthelabinthebasementofhishome.Heisholdingasampleof“real”GFPisolatedfromAequoreavictorea,notproducedbybacteria.Inordertodohisresear

8、chShimomuraestimate