cdna文库构建策略及其分析研究进展

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1、cDNA文库构建策略及其分析研究进展自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基木于•段之一。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的冃的基因,并直接用于该冃的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅口J保护濒危珍惜生物资源，而一冃可以提供构建分了标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞屮基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老

2、和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。从1976年HOFSTETTER成功的构建了第一个cDNA文库以來，构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期cDNA文库，山于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点,而丫OUNG和DAVIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来，cDNA文库构建的新方法层出不穷，但其共同冃的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需嘤。木文就近年來发展的cDNA文库的构建及其类型特点作一简要综述。1cDNA文库的构建1.1cDNA文库构建

3、的基本原理与方法cDNA文库是指某牛:物某发育吋期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基木步骤包括：RNA的提取(例如异硫孰酸弧法，盐酸弧一冇机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。由于RNA酶存在所有的生物屮，并且能抵抗诸如羔沸这样的物理环境，因此建立一

4、个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质虽的mRNA后，用反转录酶Oligo(dT)引导下合成cDNA第1链，cDNA第2链的合成(用RNA酶H和人肠杆菌DNA聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核甘酸酶和人肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体屮去、分析cDNA插入片断，扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是入噬菌体，这是因为入DNA两端具有由12个核昔酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNAo1.1cDNA全长文库经典cDNA文库的构建虽然高效、

5、简便，但文库克隆的片段-•般较小，单个克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNAo为了克隆到真正的cDNA全长，建立富含全长的cDNA文库具冇重要意义。为此，必须克服仅用mRNA的PolyA尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA文库，是指从生物体内一套完整的mRNA分了经反转录而得到的DNA分了群体，是mRNA分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA文库不仅能提供完整的mRNA信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息，此外，还可以対蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基

6、因的功能等。目前所报道的対全长文库的构建一般按照美国CLONTECH公司的SMARTcDNALibraryConstructionKit方法或GeneRacer试剂盒(Invitrogen,USA)使用说明进行。判断一个cDNA文库中的cDNA序列是否是全氏基因的cDNA,主要方法冇以下几种。1.2.1直接从序列上评价5瑞：如果冇同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因S末端进行比较来判断。如果无同源茶因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个ATG上游有无同框架的终止密码了；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5帽结构后有一段富含唬睫

7、的区域，或者是cDNA5*序列与基因纽序列屮经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的cDNA的5端是完整的。3端：同样可以用英它牛.物已知的对应基因3'末端进行比较來判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的PolyA加尾信号，或无明显加尾信号的则也有PolyA尾。1.2.2用实验方法证实可以通过引物延伸法确定5'端和3端的长度，女［1：5'端RACE,3’端RACE,或者通过NorthernBlot证实大小是否一致。1.3对cDNA文库的分析对cDNA文库质量的评价主要有两个方而。第一方而为文库的代表性，cDNA文库的代表性是指文库中包含的