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《3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、3H胸腺卩密噪核卄掺入检查法311胸腺卩密唳核廿（3IIthymidine,3IlTdR）掺入试验，是体外淋巴细胞转化试验较客观、重复性好、结果准确的方法之一。（-）原理当淋巴细胞受分裂原（PHA等）或特异性抗原刺激发生转化时，必然伴有DA的大量合成，若将具有放射性的3HTdR加到培养液内，则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量（以脉冲数表示），就能客观地反映淋巴细胞对刺激物的应答水平。3IITdR掺入法最初是利用分离纯的淋巴细胞进行试验，近年來逐渐推广采用微量全血
2、法，该法具有采样少，操作简便，并能较止确地反映整个机体免疫状态等优点。（二）器材国产FJ353型或YSJ76型液体闪烁计数器，恒温箱，水浴箱，离心机,培养瓶（10ml链霉素瓶），其他常用器材。（三）试剂1培养基RPMI1640或TC199培养液。2小牛血清50°C30min灭活后使用。3PHA同形态学方法。43IlTdR最好选用比活性为2〜1Omci/mg分子的制品，将lmci/ml溶液用生理盐水稀释为100uci/ml,于4°C冰箱保存，临用时，再用培养液稀释成10uci/ml溶液。53%冰醋酸。6浓甲酸
3、。730%H202o8闪烁液PP0（2,5二苯基口恶卩坐）5g,POPOP（1,4双（5苯基口恶哩基2苯）〕03g,无水乙醇200ml,甲苯800mlo（四）方法及结果1培养液按1%体积加青、链霉素溶液（含青霉素1万u/ml＞链霉素001g/ml）及肝素液（含肝素125u/ml）o用35%碳酸氢钠溶液调整pll值为72〜74,然后加灭活小牛血清使浓度为20%。再加所需要的PIIA,无菌分装于培养瓶内，每瓶lnil。2无菌取静脉血05〜15ml,按每毫升血加入肝素125u抗凝，进行白细胞计数及分类。3将肝素抗
4、凝血液样品注入含51培养液的培养瓶内，每瓶01ml,每份样品2〜3管，37°C培养72h。在培养结束前16〜24h,每瓶加入3HTdRluci。4培养结束后，将培养物移到离心管内，用3%冰醋酸6ml分两次冲洗培养瓶，并将冲洗液也放入离心管内，2000r/min离心lOmin,如此反复两次。5最后在沉淀中加30%H2021滴，85°C水浴加温15min,待溶液呈无色，再加浓甲酸0.5ml后，继续加热30min,使沉淀物完全消化溶解。6将消化溶解的液体移于测样杯内，用红外线灯或80°C热空气烘烤至液体体积少于0
5、1ml,加闪烁液5ml,用液体闪烁计数器测定每分钟脉冲数（cpm）o7取各管测定读数的平均值，即为01ml全血检测的脉冲数。再按血样淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。亦可用刺激指数（SI）表示试验结果。为此，须在培养时设同样数量的不加PHA的对照管，试验管脉冲数之比即为刺激指数。S1二加PHA管cpm不加PHA管cpm（五）注意事项1培养基TC199或RPMT1640培养基都能得到良好结果，EagleMEM亦较常用，其他许多种组织培养基，包括05%水解乳蛋白、Hank
6、s液也都可用于实验，但做实验动物淋转试验时，特别是检测小鼠淋巴细胞转化率时，则以RPMI1640培养基效果最好,EagleMEM亦可,TC199则不成功。2其他培养条件血样与培养基比例在1：10至1：30之间。培养容器国外多用螺纹口盖的培养管或微型培养板，置5%CO2气体环境中培养。国内采用10ml容量的链霉素瓶，塞上胶塞放普通气体环境中培养，有时发现同-•样品在不同管培养物上所得的结果差别较大，其原因可能是各管胶塞松紧不一，造成管内、外气体交流情况不同所致。3闪烁样品制备有关问题培养后制备闪烁测定样品的方
7、法大体有均相法(或称溶解法)和滤膜法两类。(1)均相法：是使培养物经过红细胞溶解，洗脱未被摄入的放射性物，沉淀大分子物质，并使之消化溶解，便于均匀分布在闪烁液中。上述方法即为均相法的一种。不同实验室的具体操作法和应用的试剂常有不同，溶解红细胞多用1%〜3%醋酸，但也有使用蒸馅水。许多实验室多用5〜10%三氯醋酸(TCA)沉淀大分子物质，使洗液不致流失，消化溶解，最后沉淀物多采用强酸和氢氧化钠。(2)滤膜法：均相法处理样品须反复多次离心沉淀，操作繁琐，耗费时间，因此有逐渐被滤膜法取代的趋势。滤膜有玻璃纤维和微
8、孔滤膜两种，肓径2〜25cm,孔径03〜045um0处理方法是先使培养物的红细胞溶解(加3%醋酸或蒸憾水)，移于滤膜上减压抽滤，再依次使约10ml生理盐水、5〜10ml的5%〜10%三氯醋酸溶液、3〜5ml无水乙醇通过滤膜，最后将滤膜移于测样杯内，加5ml闪烁液测定。⑶闪烁液：30%三联苯甲苯溶液或4%〜5%PP0甲苯溶液均可使用。如添加0.1%〜0.4%F0P0P可提高测定效率。闪烁溶剂中加入一定比例的醇类(如
