生物化学实验指导：聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

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1、实验八聚丙烯酰胺凝胶盘电泳【实验目的】1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基木原理。2.学习盘状聚内烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。单体•丙烯酰胺和交联剂■甲义双丙烯酰胺相耳作川对形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED作为催化剂，以APS作为引发剂。丙烯酰胺和甲叉双内烯酰胺的比例可决定凝胶网孔的大小，交联剂所山比重越大，凝胶的网孔就越小。ch2=c=0ch2=cc=oInh2内烯酰胺NHch2NHAPTEMEDc=och2=c甲

2、义双丙烯酰胺CHr—需』—=0CINo12H=HclCIN2-HcCH2—CHnh2nh2—ch2聚丙烯酰胺利用聚内烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素：蛋白质所帯静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向巧其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋匚I质表血电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次，蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的人小与凝胶网孔人小之间的关系。蛋片质分了越小或凝胶网孔越人，所分离样站所受阻力就愈小

3、，则在电场中的迁移率就越人。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。电压X样品静电荷迁移率—摩擦力浓缩效应可显著提高聚内烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是山较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔鮫分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶

4、液是Tris-HCl(pH6.7),该pH远低J：Tris的pK值(&1)。分离胶内的缓冲溶液是pH&9的Tris-HCl,而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH8.3的Tris-U"氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的CT在凝胶屮的移动速率较快,而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。山于二者在同一电场中，具冇相同的电流，由此形成的电压梯度导致廿氨酸离了始终跟随在C「的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在U•氨酸离子和C1N间向正极移动。当样品进入pH8.9的分离胶时，廿爼酸的解离度增加

5、，在电场中的迁移率高于样品，蛋口质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋口质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。GTris/甘氨酸pH8.9样品缓冲溶液Tris/HClpH6.7Tris/甘氨酸pH8.9—浓缩胶Tris/HClpH6.7—分离胶Tris/HClpH&9【实验材料】1.实验器材Bio-Rad公司Mini-ProteanII型电泳仪；电源（电压200V,电流500mA）；100°C沸水浴；Eppendorf管;微量注射器（50卩1或100卩1）；带盖的玻璃或册料小容器；摇床。2.实验试剂试

6、剂号配方PH1分离胶缓冲溶液lmol/LHC148.0ml三疑卬基氨基甲烷36.3g加蒸谓水到100ml8.92单体交联剂丙烯酰胺（Acr）30g甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g加熬馆水到100ml3过硫酸鞍100mg/ml4四甲基乙二胺（TEMED）5浓缩胶缓冲溶液1mol/LHC148ml三拜甲基氨基甲烷5.89g加蒸懈水到100ml6.76电极缓冲溶液It氨酸28.8g三拜甲基氨基甲烷6.0g加蒸係水到1000ml,用前稀释10倍8.37染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸憾水到10

7、0ml8示踪染料漠酚蓝0.05g溶于100ml蒸饰水9样品：蛇毒干粉200mg溶于20ml,pH6.7缓冲溶液(5)中，再加入25%蔗糖20ml和溟酚蓝(8)10ml凝胶溶液的配方试剂分离胶(ml)浓缩胶(ml)11.25-22.51.05-1.25蒸馅水6.1957.6430.050」040.0050.005总体积(ml)1010Aa浓度(g%)7.53.0【实验操作】1.凝胶柱的制备取10cmX0.6cm的玻璃管，选择较平整的一端为底端，量取7.5cm、8cm两处，画线；底端悖口川小块胶布封口，插入

8、橡皮热中，垂直放置于试管架中。用巴斯德滴管吸取分离胶，缓慢贴壁加胶到管内7.5cm处，立即加蒸懾水至8cm处。待分离胶凝固后，将胶而上的水分电掉，残留的水分用滤纸条吸干，用滴管速加浓缩胶到分离胶面上至8cm处，再小心地加一层覆盖水。2.安装电泳槽选择无气泡、无裂缝、长度合适的小玻璃管，撕掉胶布，安装到电泳仪上，注意要紧密，以防止上槽缓冲溶液漏液；向下槽注入电极缓冲液，注意用弯头滴管除去玻璃管下端的气泡；再向上槽倒入电极缓冲液淹没小管，同样用