浅谈多光子雷射扫描显微镜技术

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1、淺談多光子雷射掃描顯微鏡技術(Multi-PhotonLaserScanningMicroscopy)周美智長庚人學生理暨藥理科助理教授雷射掃描共軌焦顯微鏡技術(LaserScanningConfocalMicroscopy)的原理簡單地說是以特定波長的雷射做爲激發光源，將樣品屮的螢光染料激發，並經由針孔(pinhole)濾波的原理來成像，即二維影像(2Dimage)，除此之外更可利用雷射光對樣品做光學切片式的斷層掃描分析(opticalsection)，而後利用數據處理軟體系統將這些光學切片影像做排列重組，以對樣

2、品作一個完整的立體影像(3D)甚至加上時間的四維(4D)觀察。早期，我所使用的雷射共軌焦顯微鏡，是利用載物臺的移動來達成掃描成像原理，這種系統速度極慢，且在載物臺移動時亦可能造成分析物偏移或細胞破裂等狀況發生,後來發展出galvano-mirrorscanning技術，乃利用二片快速擺動的鏡片將激發雷射光朿導入樣品屮，藉由鏡片的快速擺動，即可在欲量測的範圍人小屮進行快速掃描及數據處理工作'而不會影響樣品組織的完整性'特別適用於現代生物醫學領域的應用傳統的ConfocalMicroscopy承襲螢光顯微鏡多使用離子雷

3、射做爲激發光源(如Argomion)，由於其激發波長(excitationwavelength)爲488nm/514nm、其散發波長(emissionwavelength)約在520〜560nm之間，故可對大多數的螢光染料物質,如FITC,SYBRGreen,Rhodamine123...等進行激發。然而有些螢光染料物質,如DAPI(DNAstain),Fura-2及Indo-1(Calciumdyes)由於其激發波長約在340〜41Onm之間，需要以紫外光雷射(UVLaser,351〜363nm,150mW)做爲

4、激發光源。由於UVLaser短譜線高能量的特性亦會造成樣品受激發部位產生漂白(blenching)»灼燒(burning)及因光化學作用所產生的毒性(phototoxicity)造成樣品細胞壞死情形發生(一般稱爲UVcytotoxicity)極不適用活體細胞的長時間觀測,因此在短短數年間(1991~1995)乂被雙光子超短脈衝雷射(two-photonpulselaser),又稱多光子紅外光雷射(multi-photonorIRlasers)技術所取代了。雙光子超短脈衝雷射最早由康乃爾人學的Dr.Denk等人應用於

5、雷射掃描共軌焦顯微鏡之上，笫一臺商業化雙光子雷射掃描共軌焦顯微鏡亦於1996年問世。與傳統單光子共軌焦顯微鏡原理所不同的是，雙光子雷射掃描共軌焦顯微鏡的雙光子激發是指受激發物種，同時吸收兩個光子，而產生相當於頻率在此二光子加成效果的單光子激發。簡單的說就是兩個700nm紅外光光子的激發能量人約與一個350nm紫外光的激發能量相當；因此，我們就可以使用700nm雙光子紅外光雷射來取代傳統350nm單光子紫外光雷射，而有下列優點：•紅外光的波長較長，對樣品的吸收較低，因此可以觀測到細胞內部深層顯微影像(deeperim

6、agingandpenetration)。•減少因光化學作用所產生的毒性造成樣品細胞壞死情形發生，更適合活體細胞使用(localizedphotochemistryinthesample,improvedcellviability)。•雙光子僅在焦點(singlevoxel)成像，因此不再使用針孔濾波即可成像，有利於觀察高散射性樣品，並可避免單光子雷射產生在焦點前後(betweenfront&backfocalplane)漂白(blenching)及背景干擾現象(improvedsensitivitythrough

7、reducedbackgroundandincreasedcollection)°•一套可調式多光子超脈衝雷射(Femtosecondultra-pulsetunablemulti-photonTi:SapphireLaser,680nm-1050nm)即可取代數隻傳統固定波長單光子雷射由紫外光到紅外光波長激發範圍，使用上更加經濟方便。•適合活體細胞上長時間之動力學反應觀察與使用(Livecellstudiesandtime-coursekineticapplication)這種雷射影像分析方法已被廣泛用於臨床醫學

8、硏究，在不久的將來，多光子雷射掃描顯微鏡系統應能在活細胞硏究的生物醫學領域有更進一步的突破，以上淺論願與您共勉之。Example1:Time-lapseconfocalDI23imagesrevealsubstantialincreasesinmROSinvisiblelaserirradiation-inducedRBA-1cells.Aftervisib