多光子随机扫描显微镜的光学设计与构建

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1、*摘要多光子激发扫描成像技术在生命科学研究领域已得到广泛的应用，相比于其他成像技术，多光子激发荧光成像技术对生物体的光损伤小，能够进行深度层析成像和长时间观测，且天然具有高空间分辨率。光学层析能力来自于多光子激发荧光局部激发的特点，只有在激光汇聚焦点位置才能实现多光子荧光激发，而且激发光源为超短脉冲激光。现有的商业化激光扫描显微镜中，一般使用xy扫描镜控制激光束进行扫描，但是每秒只能得到几帧(512×512)图像，远不能满足功能性研究中快事件(ms级甚至µs级)检测的需要。为了对生物领域的快事件进行检测，

2、人们开始尝试开发一种基于二维声光偏转器(acousto-opticdeflector，AOD)的激光扫描显微镜。相比于其他扫描技术，声光偏转器扫描快速(100K)、稳定(无任何机械惯性)，而且能实现随机扫描，具有不可替代的功能。本论文详细描述了自行研制的基于二维声光偏转器的多光子随机扫描显微镜的光学设计与构建。通过光学设计，确定了系统的光路，采用通用的光学镜片和调节架完成系统的构建。系统采用单棱镜很好地补偿了二维声光偏转器引起的超短脉冲激光的色散，克服了限制声光偏转器在多光子激发扫描显微镜应用的技术难点，

3、提高了成像的信噪比，而且系统具有高时间分辨率(10µs)和高空间分辨率(<1µm)。目前还没有商业化的多光子随机扫描显微镜，自行研制系统能提前享有多光子随机扫描成像技术的好处，而且花费远低于目前商业化的激光扫描显微镜。在应用上，自行研制的系统也更加灵活，可根据特定的需求对系统做出调整。但目前系统仍是开架式的，占用空间较大，集成度不高。特别是对于只关心其生物应用的研究者，需要将系统进一步集成，做成模块化的产品，方便生物研究者使用。关键词：激光扫描显微成像多光子荧光成像随机扫描声光偏转器超短脉冲激光色散*本文

4、工作由国家自然科学基金(30370463，60278017，30328014，60025514)，国家重点基础研究发展计划(2004CB520804)资助完成IAbstractMultiphotonlaserscanningmicroscopyhasgreatfutureandsignificantapplicationsinbioscience.Comparedwithotherimagingtechnology,multiphotonmicroscopyhasmanyadvantagessuchasl

5、owdamagetoorganism,depthtissueimaging,high-resolution,andimagingin-vivoforlongtime.Multiphotonexcitationhasfemtolitermultiphotonexcitationvolume,whichenablesitwithopticalsectioningcapability.Thexymirrorsusedtobethescannersincommonlaserscanningmicroscopy,a

6、ndthemicroscopycanacquireonlyseveralmaps(512×512)persecond.Tillnow,thereisnosuchalaserscanningmicroscopythatcandetectfastsignal(msorµs).Inordertostudyfasteventsinbioscience,peopletrytoemploytwoorthogonalacousto-opticdeflectors,whichsteerapulsedinfraredlas

7、erbeamsuitedformultiphotonexcitationinaninertia-freemanner.Inthispaper,arandom-accessmultiphotonmicroscopyisdescribedindetail.Throughopticaldesign,wediscusshowtoconstructtheopticalpathofthemicroscopy.Thesystememploystwoorthogonalacousto-opticdeflectorswhi

8、chwillcausesignificantdispersion.Asingleprismwasinsertedintotheopticalpathtocompensatethedispersion.Aftercompensationofthedispersion,thesignaltonoiseratioandtheresolutionincreasesignificantly.Nowadays,thereisstillno