大肠杆菌基因工程-9.22

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1、基因表达系统原核表达系统真核表达系统蓝藻表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统植物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统第五章外源基因的表达一、大肠杆菌基因工程二、酵母杆菌基因工程三、哺乳动物基因工程四、高等植物基因工程五、外源基因表达产物的分离纯化一、大肠杆菌基因工程E.coli作为表达外源基因受体菌的特征外源基因在E.coli中高效表达的原理E.coli基因工程菌的构建策略基因工程菌的遗传不稳定性及其对策利用重组E.coli生产人胰岛素（一）E.coli作为表达外源基因受体菌的特征E.coli表达外

2、源基因的优势：全基因组已测序，共有4,405个开放阅读框架，大部分基因生物学功能已鉴定；基因克隆表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。E.coli表达外源基因的劣势：缺乏对真核生物蛋白质的翻译后加工修饰系统，如糖基化、磷酸化；缺乏对真核生物蛋白质的复性功能，表达产物多以无活性的包涵体形式存在；内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量内毒素即可导致人体热原反应。（二）外源基因在E.coli中高效表达的原理强化蛋白质生物合成

3、抑制蛋白质产物降解恢复蛋白质特异性空间构象启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数强化蛋白质生物合成1、启动子(promoter,P)启动子：位于结构基因上游，能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列，长40-60bp。因此，E.coli表达载体所用的启动子必须是E.coli启动子。没有启动子，基因就不能转录。E.coli的RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。位于转录起始点上游35bp处，由10bp组成，5’-TGACA。E.coli启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：位于转录起始点上游5-10bp处，由

4、6-8bp组成，5’-TATAAT，富含A和T，又称TATA盒。-10区：-35区：-35区与RNA聚合酶s亚基结合-10区与RNA聚合酶的核心酶结合在转录起始点附近，DNA被解旋成单链，RNA聚合酶使第1和2个核苷酸形成磷酸二酯键，并在其作用下向前推进，形成新生mRNA链。TGACATATAAT-35区-10区+1位转录起始点开始转录-10区和-35区的碱基组成及其间隔序列。启动子和外源基因转录起始点之间的距离。启动子的强弱取决于：启动子是控制外源基因转录的重要元件，mRNA生成速率与其强弱密切相关。-10和-35区与保守序列（5’-TA

5、TAAT、5’-TGACA）相似度越高，启动子活性越强。-10和-35区的间距越接近17bp，启动子活性越强。-10区和-35区的碱基组成及其间隔序列：大多数E.coli启动子与所属基因转录起始点之间的距离是6-9bp，但对外源基因而言，这个距离范围未必最佳。启动子和外源基因转录起始点之间的距离：1）启动子最佳距离的探测目的基因EEAEE启动子A酶切开Bal31酶解目的基因将目的基因插在一个强启动子下游，若克隆菌内检测不到mRNA，有必要考虑调整启动子与基因之间的距离。2）启动子的筛选：探针质粒pKO1的报告基因：半乳糖激酶基因galK终止

6、子Amprori无启动子的galKpKO13.9kb用同位素32P标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖的32P的放射性强度，可推算galK表达的半乳糖激酶的量，由此比较启动子的强弱。3）启动子的构建：-35区序列-10区序列启动子来源PlacPtrpPLPrecAPtacTTTACATTGACATTGACATTGATATTGACATATAATTTAACTGATACTTATAATTATAATPtac=3Ptrp=11Plac双Plac串联=2.4Plac乳糖操作子色氨酸操作子噬菌体早期操作子recA基因Ptrp-35区+Plac-10区4

7、）启动子的可控性：外源基因的全程高效表达，会对E.coli的生理生化过程造成不利影响。外源基因持续高效表达的重组质粒，在细胞若干次分裂后，会部分甚至全部丢失，导致重组菌不稳定。措施：利用可控性启动子，调整外源基因的表达时序，通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长的某一特定阶段。目前广泛应用的E.coli可控性启动子来自相应的操纵子，都含有与阻遏蛋白特异性结合的操纵子序列，其介导的外源基因在E.coli中通常以极低的基底水平表达。乳糖启动子Plac的可控性：高效转录乳糖、IPTG诱导PlacOlac乳糖、IPTG可解

8、除阻遏作用，诱导Plac介导的目的基因表达。PlacOlac野生型Plac与其控制区Olac偶联在一起。基底水平转录阻遏蛋白无诱导物存在时，Plac受阻遏蛋白阻遏，转录呈基底水平